2023年4月28日，我國第一個基因編輯生物安全證書授予舜豐生物的基因編輯大豆，預示著基因編輯育種在我國的規范化和逐步合法化。目前雖然在多種食藥用菌中成功構建了CRISPR/Cas9系統，但多數物種僅限于技術的可行性，靶基因多限于URA3/pyrG，少數應用于代謝產物合成通路解析等，未對影響表型或性狀改良的基因進行編輯，即未能在菌種選育中得到應用。

2022年中國科學院微生物研究所董彩虹研究員團隊在蛹蟲草中建立了無痕的CRISPR/Cas9基因編輯體系，可實現單、雙基因的高效無痕編輯和精準敲除，為蛹蟲草基因編輯育種奠定基礎（Meng et al., 2022; https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35829671/），而遺傳學和育種研究中基因敲入與敲除同樣重要。

外源基因的插入往往會影響靶位點基因、側翼鄰近基因的表達以及染色質狀態，進而對宿主產生不良影響。基因組安全位點（Safe harbor）為外源基因提供一個安全可靠的停泊“港口”，使得外源基因既可以穩定高效表達，同時不會導致宿主產生任何可識別的表型變化。以基因組、轉錄組數據為基礎，在蛹蟲草基因組中鑒定出多個安全位點，通過CRISPR/Cas9系統對其進行敲除和敲入驗證，得到第一個可用的安全位點CmSH1。在此基礎上，構建了一種安全位點靶向的CRISPR/Cas9基因敲入系統，通過簡單的一步克隆連接即可構建敲入載體，實現基因過表達或外源基因在安全位點的定點整合。利用該系統對蛹蟲草疏水蛋白基因Cmhyd1進行定點過表達，基因編輯菌株“白毛病”抗病性增強，對蛹蟲草農藝性狀影響微弱且不影響其子實體商品性。PCR測序和基因組重測序確認Cmhyd1過表達菌株無脫靶和外源基因、序列殘留。

2023年10月，該研究結果以“Safe-Harbor-Targeted CRISPR/Cas9 System and Cmhyd1 Overexpression Enhances Disease Resistance in Cordyceps militaris”為題在Journal of Agricultural and Food Chemistry雜志在線發表。

本研究獲得了食用菌基因組中第一個安全位點，實現了基于CRISPR/Cas9系統的基因定點敲入。本研究也是無痕基因編輯獲得的第一例抗病菌株，為其他食用菌抗病育種提供借鑒，對病害的防控具有重要的科學意義和實踐價值。該研究目前已經申請專利（專利申請號：202211257442.5）。本工作主要由博士生研究生劉晴完成，得到國家重點研發項目（2022YFD1200602）和國家自然科學基金面上項目（31872163，32272786）的資助。

原文鏈接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jafc.3c05131