(1)母種制作
組織分離法簡單易行，后代變異小，能保菌株的優良特性，它是生產上常用的菌種分離法。種菇應選擇外觀典型，大小適中，菌蓋表面鱗片較少，顏色純白無病蟲害的頭潮菇，采摘種菇應在雞腿菇生長的棒狀后期或梭形前期。
母種培養基可選擇PDA培養基，也可用如下配方：小麥600克，鮮子實體100克，葡萄糖20克，蛋白胨3克，磷酸二氫鉀0．5克，磷酸氫二鉀1克，硫酸鎂1克，硫酸鈣1克，瓊脂25克，水1000 毫升。母種培養基的制作過程及無菌分離技術同其它食用菌制種技術，不再介紹。
(2)原種制作
雞腿菇原種制作多采用麥粒種，其配制方法如下：麥粒浸泡24小時左右，至麥粒露白，用清水沖洗后煮沸20～25分鐘，撈出瀝干水后加1％石膏粉，20％已粉碎的麥稈發酵料，然后裝瓶，滅菌、無菌接種與培養。此配方菌絲生長旺盛，生長速度快，在25℃環境下750毫升菌種瓶12~15天可長滿瓶。
(3)栽培種的制作
雞腿菇栽培種培養基多用棉殼、麥稈發酵料配制。配方如下：麥稈牛糞發酵料33%、麩皮10 %、棉籽皮50％、玉米粉5％、石灰2%。先將麥稈粉碎中加牛糞20％～30%，加石膏2％，堆積發酵5～6天，然后加入其它原料，發酵48小時即可裝袋滅菌，無菌接種與培養。此配方比單純用發酵料及單純用棉籽皮有發酵快、菌絲壯的優點。
