（3）器械分離法：應用顯微操作器，直接挑選單孢子，移至PDA 平板中進行孢子刺激萌發培養，獲得單孢純種。
①孢子懸浮液制備：同稀釋分離法，孢子濃度控制在1000個/毫升；
②平板涂布：將稀釋后的孢子懸浮液滴0.1毫升于平板上，用無菌的T氏棒進行均勻涂布，每個平板含孢子大約100個左右；
③鏡檢分離：待涂布均勻的平板瓊脂表面水分干燥后即可于顯微鏡下觀察，當在視野中心見到孢子，而視野周圍無其它孢子時，可用顯微操作器操縱玻璃針把孢子從培養基表面挑取，隨后把孢子轉移至PDA平板的表面上，進行孢子萌發培養，孢子萌發培養須使用蘑菇氣生菌絲刺激培養，才能提高萌發率，培養的具體操作方法與涂布分離法相同。
（4）單孢子菌落接待：當孢子經過10天的刺激培養， 肉眼可見到菌絲生長而成小菌落，應及時用打孢子器把該菌落分離，每天都應觀察孢子萌發情況， 如果不及時把菌落移接，該菌落會快速生長而影響較遲萌發單孢子的分離。
二、組織分離法
組織分離法是利用子實體組織來分離獲得純菌絲的方法。組織分離系一種無性繁殖法，雙親的染色體沒有經過重組，因此組織分離基本上可保持親本的生物不特性，棒操作簡便，取村廣泛，在過去傳統的穩定菌株中常采用此方法進行菌種的分離，退化不明顯，但是隨著蘑菇雜交菌種的應用，由于雜種本身所具有的不穩定，組織分離常造成菌株的退化，目前生產上很少采用，只是進行野生菌株分離時，才比較常用。其方法如下：
①挑選種菇：其標準與孢子收集要求相同；
②菇體消毒：將子實體菌柄基部切除，置接種箱內，用75%酒精對菇體表面進行消毒；
③組織分離：解剖刀經火焰滅菌，在菇柄中部縱切一刀， 用手掰開菌再用接種鏟在菇蓋與菇柄交界處切五個小方塊，隨后挑取一小塊組織，迅速移接到PDA斜面培養基上，置24℃下培養，待組織塊長出菌絲無污染即為純種。
