1、分離方法。羊肚菌的分離方法與其它食用菌大不相同。它需要一種助生菌與羊肚菌菌絲共生時才能出菇。這種助生菌長期活動在土壤中，有時以芽孢菌形式出現，有時以菌絲形式出現。它為羊肚菌的原基形成和子實體生長發育起著至關重要的作用。因此，從土壤中分離該菌比其它任何方式分離要好些。但從土壤分離難度太大，成功率不到萬分之一，并且難以分辨，所以只有采取羊肚菌基腳土分離，才能真正找到羊肚菌的出菇菌絲。初學者可在四川綿陽市食用菌研究所購買培養好的羊肚菌優良母種，并參加現場培訓。
2、操作過程。在羊肚菌生長的周圍，可見白色菌絲充滿土壤。從土壤中挑選這種菌絲容易成功。現介紹兩種土壤分離的簡易方法：一種是土壤直接分離，另一種是浸提分離。土壤直接分離法：在羊肚菌生長的地方去掉羊肚菌，取周圍5厘米以內的土壤，去掉表層，把土壤放入無菌接種箱內，然后放入試管培養基，進行接種箱空間消毒。即按接種箱每立方米空間用甲醛10毫升，高錳酸鉀5克，混合產生氣體消毒，半小時后才可操作。將基腳土用接種針挑取黃豆大小一塊，迅速放到試管內的空白培養基上，每管放一塊，塞上棉塞，接種后取出培養。浸提分離法：將基腳土用無菌水稀釋，澄清后用接種針蘸取少量溶液，滴到試管內的空白培養基上，塞上棉塞后取出培養。
分離后，放在12～18℃溫度下培養觀察。3天后培養基上萌發菌絲，每天仔細檢查每支試管的發菌及變化情況。區分和認識各類雜菌是最關鍵的核心技術。真正的羊肚菌菌絲最初為灰白色，生長很快，時間長會變成棕黃色，有時會出現菌核，母種7天長滿試管，原種、栽培種15天可長滿瓶底。是否分離成功，必須做栽培出菇試驗，待出菇后才能準確認定是否羊肚菌的菌種。一旦菌種分離成功，在以后的轉接過程中要小心，不能再讓雜菌感染，必須把好高溫滅菌關和接種消毒關，才能保證菌種質量和成活率。
