靈芝與糙皮側耳原生質體融合子 生物學特性的初步研究（ 2004.02.14)

王淑珍1，范俊1，揚家峰1，揚英杰1，白晨2(1上海師范大學生命與環境科學學院，上海200234；

2復旦大學生命科學學院，上海200433)

靈芝(Ganoderma lucidum)是滋補強壯、扶正固本的珍貴藥用真菌，隨著科學技術的發展，對其研究更加深入，但未見過有關通過遺傳育種改變靈芝擔子果木栓質化生物學特性的研究報道。若將外源DNA導入靈芝細胞，嵌入細胞的遺傳物質結構中，就有可能改變其木栓質化遺傳特性。本研究是在對靈芝、糙皮側耳及其融合子基因組RAPD分析…的基礎上，分析檢測其部分生物學特性，以期了解融合子木栓質化改變程度及木栓質化與其他生物學特性的相關性。

1材料與方法

1．1材料

1．1．1菌株長白山野生紫芝誘變高產菌株CJL990[2]，由上海師范大學王淑珍研究組提供；糙皮側耳(Peurotus ostreatus)菌株農科2號，引自上海市農業科學院食用菌研究所。

1．1．2 PDA培養基供測定菌絲生長速度用。

1．2方法

1．2．1菌絲生長速度的測定將靈芝、糙皮側耳及其融合子(F1～F19)菌株分別接種于PDA培養基上，28℃培養7d，每天測量菌落生長直徑。兩親本與每株融合子均重復三次，計算平均值。

1．2．2液態培養生物量的比較分別取10小塊直徑O．15～0．25cm、于斜面上生長良好的靈芝、糙皮側耳及其融合子菌絲體，將其接入PDA液體培養基，于28℃、130r／min搖床培養。7d后，過濾收集菌絲體。用無菌水沖洗3遍，吸干水分置于培養皿中，于105℃烘干至恒重，記錄干重。融合子及親本菌絲均重復三次，求平均值。

1．2．3融合子菌絲形態的觀察分別在PDA培養基上插片培養親本菌絲和融合子菌絲，待菌絲生長到插片上0．5～0．7cm后，于200倍顯微鏡下觀察菌絲形態特征并拍照。

1．2．4菌絲木栓質化程度的測試將靈芝、糙皮側耳及其融合子(F1～F19)分別接種于裝200mL PDA液體培養基的500mL三角瓶中，于28℃淺層培養15d，長成直徑8cm、厚0．3cm的濕菌絲膜，再通過GB453-89恒速加荷法測定菌絲膜的抗拉強度，間接反映菌絲木栓質化程度。

2結果

2．1菌絲生長速度

靈芝、糙皮側耳及其融合子(F1～F19)菌絲在PDA固體培養基中的生長速度見表1。

從表1可見，所有融合子7d的平均菌絲生長速度為5．08cm，介于兩親本之間。相對于靈芝，F1、F9的菌絲生長速度明顯減慢，而F3、F6、F7、F12、F13、F14、F15、F16、F17、F18和F19的菌絲生長速度則明顯提高。菌絲生長速度最快的F8，已與糙皮側耳的菌絲生長速度相同。

根據親本和所有融合子菌落直徑每天的平均生長值繪圖。從圖1可見，融合子菌絲的平均生長速度介于兩親本之間。

圖1 親本及其融合子在PDA培養基上的菌絲生長速度

Fig．1 Comparison Of mycelial growth rate 0f parent strains and the fusants On PDA medium

2．2液體培養靈芝、糙皮側耳及其融合子的生物量

從表2可見，融合子與親本在液體培養時生物量差異不大，其中菌絲生長速度較快的F8，生物量較高，所有融合子的平均生物量為7．99g/7d，介于兩親本之間，液體培養和固體培養的親本及其融合子的生物學特性具有一定的相關性。

2．3靈芝、糙皮側耳及其融合子(F8)的菌絲形態

在200倍顯微鏡下觀察菌絲體，比較菌絲形態特征，箭頭所指為鎖狀聯合(圖2～4)。從圖2可見，靈芝及其融合子的菌絲長得較緊密，糙皮側耳菌絲較疏松。融合子菌絲感官觀察較透明，經測微尺測定，其直徑為6．5～8μm，大于兩親本菌絲(靈芝菌絲3～5μm，糙皮側耳菌絲4．5～6μm)。

2．4靈芝、糙皮側耳及其融合子菌絲木栓質化程度的比較

由表3可見，以抗拉強度表示的融合子菌絲的木栓質化程度與靈芝菌絲相比均有不同程度下降。F12菌絲的抗拉強度為23．6N，其木栓質化程度幾乎與靈芝相同；F8菌絲的抗拉強度最小，為16．9N，但也遠遠大于糙皮側耳的3．8N。菌絲抗拉強度的大小反映其韌性的強弱，抗拉強度大，其韌性也大，說明其木栓質化程度高。

3討論

3．1靈芝和糙皮側耳原生質體融合子與雙親的生物學特性具有不同程度的差別。靈芝、糙皮側耳及其融合子的基因組RAPD…和同工酶的分析[3]結果表明，融合子的譜帶有的與靈芝的相同，有的與糙皮側耳的相同。雖然本研究未進一步進行分子雜交法驗證[4]，但由RAPD的原理也足以說明，融合子的譜帶不是雙親譜帶的簡單疊加，融合子中還出現了新的譜帶，是原生質體融合引起細胞核或細胞質基因高頻重組的結果。初步證明，融合子生物學特性的改變與基因相關，從融合子與兩親本的相似系數來看，兩株融合子的平均Spf為60．65％，而Spf為32．35％。可以看出融合子與靈芝更接近。

3．2融合子菌絲的木栓質化程度與靈芝相比均有不同程度的下降，其中，F8的降幅最大。菌絲形態變化也大，表明融合子菌絲的木栓質化程度與其它生物學特性(如菌絲的透明度和直經大小)具有一定的相關性，即菌絲生物學特性變化大，其木栓質化程度就低。

3．3 19株融合子菌絲木栓質化程度不同，是否決定菌絲或子實體木栓質化生物學特性的基因較復雜，不是單一基因，尚有待進一步研究。

參考文獻[1]王淑珍，白晨，范俊，等．靈芝與糙皮側耳原生質體融合子基因組RAPD分析[J]．食用菌學報，2003，10(1)：1--4．

[2]王淑珍，白晨．靈芝孢子誘變與菌絲高長速菌株選育[J]．中國食用菌，2000，106(6)：6--9．

[3]王淑珍，范俊，高雁，等．孢子誘變菌株CJL990靈芝過氧化物酶和酯酶同工酶的研究[J]．上海師范大學學報(自然科學版)，2000，29(4)：69--73．

[4]潘迎捷，陳明杰，汪昭月．原生質體的融合子的遺傳驗證[J]．食用菌，1991，13(6)：14～15．