靈芝與糙皮側耳原生質體融合子基因組RAPD分析

王淑珍?1 白 晨??2? 范 俊?1 高 雁?1 揚家峰?1 揚英杰?1

? （1 上海師范大學生命與環境科學學院，上海 200234；

?? 2復旦大學生命科學學院， 上海 200433）

作為一種傳統的滋補強壯、扶正固本的珍貴藥用真菌，靈芝?(Ganoderma lucidum)幾千年來一直被廣泛用于臨床治療和人體保健。隨著科學技術的發展，近10年來對靈芝的栽培、菌絲體工業化深層發酵及有效成分的研究逐漸深入。隨著分子生物學和微生物遺傳學 研究的進展，應用原生質體融合技術進行靈芝種內原生質體融合的研究，以期獲得優質高產的靈芝菌株。然而，這些研究主要集中在栽培、有效成分、藥理及臨床應用方面，未見通過 遺傳育種改變靈芝擔子果木栓質化生物學特性的研究報道。現己發現，靈芝屬近百種靈芝的擔子果均呈軟木質或木質化，這種組織結構不僅給靈芝的食用和藥用帶來許多加工工藝上的 麻煩，而且由于木栓質化，使靈芝不能象其他肉質和革質食用菌那樣食用，所以不可能做到物盡其用。即使是深層發酵的靈芝菌絲體，口感也近似軟木質化結構，難以咀嚼，如果加 工成食、藥用原輔料，微細化難度也遠大于一般食、藥用菌菌絲體。靈芝這種遺傳特性限制了其應用范圍。近年來，利用外源遺傳信息改變遺傳特性的方法已成為遺傳育種中新的研究 焦點。若將外源DNA導入靈芝細胞，嵌入到細胞的遺傳物質中，就有可能改變其木栓質化遺傳特性。

?本研究旨在保持靈芝原保健功能的前提下，根據細胞工程和分子生物學理論，以肉質食用菌擔子果為外源DNA供體，通過原生質體融合技術，探討改變其木栓質化生物學特性的方法與技術。

1 材料與方法

?? 1.1 菌株

?靈芝CJL990菌株系長白山野生紫芝的誘變高產菌株［1］，由上海師范大學王淑珍研究組提供。糙皮側耳農科2號，引自上海市農業科學院。融合子F3、F8，由上海師范大學王淑珍研究組根據其優良生物學特性初篩獲得。

? 1.2 試劑

?12種引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，核苷酸序列見表1。

?表1 核苷酸序列及試驗編號

Table 1 The experiment nos. and the nucleotide sequences of 12 primers

試驗編號?Experiment nos.

核苷酸序列（5’→3’）Sequences of the nucleotide

試驗編號?Experiment no s.

核苷酸序列（5’→3’）Sequences of the nucleotide

01

GGGTAACGCC

07

CTACTGCCGT

02

TGAGGGTCCC

08

TTATCGCCCC

03

GGTGCGGGAA

09

GAGTCTCAGG

04

GTGACATGCC

10

CACCAGGTGA

05

TCAGGGAGGT

11

CTTCACCCGA

06

AAGACCCCTC

12

TCACCACGGT

? LETS緩沖液組成：100mM LiCl 0.424g，10mM EDTA 0.372g，20mM Tris 0.242g，0 .5% SDS 0.5g。將上述試劑溶解在80mL重蒸水中，用鹽酸調節pH至7.8～8.0，定容至100mL，加入蛋白酶K，至終濃度為50mg/100mL。

?50×TAE緩沖液組成：Tris 242g，冰醋酸57.1mL，0.5M EDTA(pH8.0)100mL，加蒸餾水至 1L。

?上樣緩沖液組成：40%蔗糖，0.25%溴酚藍。

?苯酚∶氯仿∶異戊醇：于50mL水飽和苯酚中加入24mL氯仿和1mL異戊醇，使其配比為25∶2 4∶1。

?1.3 總DNA的提取??［2，3］?

?菌株接種于液體培養基中，于26℃培養10d后，過濾收集菌絲體。取0.1g菌絲體，無菌重 蒸水淋洗后用濾紙吸干，放入1.5mL的離心管中，每管加400μL LETS緩沖液，并用研棒研磨菌絲。加500μL苯酚、氯仿、異戊醇混合液（25∶24∶1），充分混勻，14000r/min離心10 min。取300μL上清液于一新的離心管中，加600μL(2倍體積)無水乙醇，混勻，14000r/min 離心10min，去上清液，真空干燥沉淀物后加40μL無菌重蒸水，溶解，用華舜公司的植物總 DNA抽提柱過柱純化，70%乙醇（或Wash Buffer）離心洗滌兩次，最后加20μL無菌重蒸水，于65℃洗脫。取1μL純化后的總DNA，用0.8％的瓊脂糖凝膠，在1×TAE緩沖系統中電泳檢測 。

?1.4 RAPD反應

?模板DNA定量：用紫外分光光度計測定提取的不同菌株的DNA濃度，稀釋，使其終濃度為5～10ng/μL。

?RAPD反應體系： 反應體系的總體積為25μL， 其組分為2.5μL 10×PCR Buffer ， 2μL2mM MgCl?2，1μL DMSO，1.5μL dNTP，1μL Taq酶（Sangon），5μL隨機 引物（3.3ng/ μL），1μL DNA稀釋模板（以ddH2O為空白對照），11μL ddH?2O。

?反應條件：反應在MJ Research PTC?225 PCR儀上進行。擴增反應程序為：94℃ 變性5min，92℃變性1min，36℃退火1min，72℃延伸2min，共進行45個循環，最后72℃補平 10min，終止溫度為4℃。

?產物檢測：取10μL反應液，加2.5μL電泳樣品緩沖液，在1×TAE電泳緩沖體系中，用?1 .4％?瓊脂糖凝膠電泳分離DNA擴增片段，EB染色，于凝膠分析儀下觀察結果并拍照。

? 1.5 相似系數的統計

?對擴增DNA片段按相似率Sxy=2?Nxy/(Nx+Ny)×100%進行相似指數(Simi larity index)分析，其中Nxy是比較后兩種材料x和y共有的DNA片段數目，Nx和Ny分別為材料x和y各自的DNA擴增片段數目。

2 結果

? 2.1 引物的篩選

?試驗所采用的12個隨機引物中，有4種引物能有效地同時對靈芝、糙皮側耳及其融合子的D NA進行擴增，它們分別是07、10、11和12號引物。用這4種隨機引物進行重復實驗，擴增出 的隨機片段大都在3.5kb～0.5kb之間(圖1，圖2)。

表2 4種隨機引物的擴增譜帶

?Table 2 The amplication bands with 4 random primers

供試材料?Materials tested

譜 帶總數Total no.?of the bands

GFP共同譜帶GFP common?bandsGP

GP共同譜帶 GP common?bands

GF共同譜帶GF common?bands

FP共同譜

FP common?b ands

靈芝?G.lucidum? (G)

52

--

12

--

--

融合子 Fusant (F3)

57

9

--

35

12

融合子 Fusant (F8)

60

15

--

32

20

糙皮側耳 ?P.ostreatus? (P)

40

--

12

--

--

? 1～6號泳道分別為G、 F3、 P、 G、 F3、 P用不同引物的擴增結果

?M為分子量標記，從上到下依次為10kb、 8kb、 6kb、 5kb、 4kb、 3kb、 2kb、 1.5kb 、 1kb和0.5kb，N為空白對照

?Lanes 1～6 are the amplicons of G，F3，P，G，F3，P amplified with different pr imers

?M： Molecular weights from up to down are 10kb，8kb，6kb，5kb，4kb，3kb，2kb ，1.5kb，1kb and 0.5kb resp. N： The blank contrast

?

圖1 融合子F3的RAPD分析?Fig.1RAPD analysis of fusant F3

?????????????

? 1～6號泳道分別為G、 F8、P、G、F8、P用不同引物的擴增結果

?M為分子量標記，從上到下依次為10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3kb、2kb、1.5kb 、1kb和0.5kb，N為空白對照

?Lane 1～6 are the amplicons of G，F8，P，G，F8，P amplified with different pri mers

?M： Molecular weights from up to down are 10kb，8kb，6kb，5kb，4kb，3kb，2kb ，1.5kb，1kb and 0.5kb，resp. N： The blank contrast

?圖2 融合子F8的RAPD分析?Fig. 2 RAPD analysis of fusant F8

? 2.2 四個樣品擴增譜帶相似率

?根據表2的數據計算F3、F8兩融合子與兩親本的相似系數：SGF3=64.2%，SGF8=57.1%；SPF3=24.7%，SPF8=40.0%；SGP=26.1%。

? 2.3 融合子和親本株擴增的譜帶類型

?從圖1和圖2擴增結果可見，靈芝與糙皮側耳相同的譜帶較少(S??GP?＝26.1%)。二株融合子的平均SGF＝60.65%，而SPF＝32.35%，可見，融合子的生物學特性與靈芝更接近。

3 討論

?3.1 本研究所制備的靈芝和糙皮側耳原生質體，是采用雙層培養法進行原生質體再生［4］，將靈芝和糙皮側耳兩親本對潮霉素自然抗藥性的差異結合原生質體滅活［ 5］作為融合子篩選的依據。

?3.2 根據RAPD原理，每種隨機引物擴增的1條譜帶代表了被擴增的基因組中的一個遺傳位點。因此，本研究中四種隨機引物總共檢查了靈芝的52個位點，兩株融合子的117個位點（平均每株58.5個），糙皮側耳的40個位點，表明融合子與兩親本基因組中的遺傳位點總數有差別。

?3.3 靈芝與糙皮側耳為不同目的大型藥用菌與食用菌。靈芝屬多孔菌目，靈芝屬；糙皮側耳屬傘菌目，側耳屬。兩者親緣關系較遠，其基因組內的同源序列較少，只有當引物結合 位點之間的序列區段在兩親本之間同源時，PCR擴增產物的帶型才會相同，從擴增結果來看，相同的譜帶較少（SGP=26.1%），差異明顯（圖1，圖2）。

?3.4 融合子的譜帶有的與靈芝相同，有的與糙皮側耳相同，其基因組DNA既有與靈芝同源的序列，又有與糙皮側耳同源的序列。筆者對靈芝、糙皮側耳原生質體融合子基因組進行了 RAPD分析。初步證實，該融合子確為兩親本原生質體融合后的融合子，將在此基礎上進一步做分子雜交［6，7］試驗。

?3.5 根據Williams等（1990）的實驗，RAPD符合孟德爾遺傳規律，雖然本實驗中發現雙親的共有譜帶基本上都可在融合子中找到，部分單親譜帶也出現在融合子中，但融合子的譜 帶不是雙親譜帶的簡單疊加，融合子中還出現了新的譜帶（圖1，圖2），這可能是融合后基因重組引起引物結合位點改變的結果。如果將融合子擴增譜帶分別與兩親本作比較，從融合 子與兩親本的相似系數來看，兩株融合子的平均SGF為60.65%，而SPF為32.35% 。可以看出融合子與靈芝更為接近，符合我們的育種目的。

?3.6 有關靈芝木栓質化生物學特性改變與否及改變程度，目前仍在研究。

?? 參 考 文 獻

? ［1］ 王淑珍，白 晨. 靈芝孢子誘變與菌絲高長速菌株選育［J ］.中國食用菌，2000，106（6）：6～9.

?［2］ Lee SB, Taylor　JW.Isolation of DNA from fungal mycelia and singl e spore.In: PCR Protocols:A guide to methods and applications (Gelfand MA , Sninsky DH, White JJ, TJ Eds.)［M］. New York：Academic Press，1990,282～287 .

?［3］ Sobral BWS, Honeycutt RJ. Hight output gentic mapping of p olyploids using PCR?generated markers［J］. Theor Appl Genet，1993，86:105～11 2.

?［4］ 李 剛，李寶健.影響靈芝原生質體再生的幾個因素［J］．食用菌學報，1998，5 （3）：12～17.

?［5］ 彭衛憲，陸大京.用滅活原生質體融合進行高溫香菇育種［J］.真菌學報，1987，6 （3）：184～192.

?［6］ 陳明杰，譚 琦.應用RAPD技術對香菇融合菌株進行遺傳鑒定［J］. 食用菌學報，1997，4（4）：17～20.

?［7］劉國振，劉振岳，賈建航，等.用RAPD方法對平菇、香菇屬間原生質體融合 子的研究［J］.遺傳，1995，2（1）：7～11.