作物物理誘變新技術研究進展

林　彤　　歐　琳

（福建師范大學，福州　350007）

摘　要　概述了激光生物工程技術和離子束注入技術的作用機理、特點和產生的生物學效應，及其在作物誘變育種中的研究與應用。

關鍵詞　作物誘變　激光生物工程　離子束注入

　　選育優良品種是促進農業生產發展的必由之路。大量研究和生產實踐表明，誘變育種可克服常規育種周期長、進程慢、難以獲得突變性變異品種的缺點，可在創造作物新種質、新材料和解決育種工作中某些特殊問題取得突破和高速發展，繼γ射線、中子、EMS、NaN等傳統的理化誘變手段之后，激光技術和離子束注入技術在探討誘變育種新途徑方面的應用，成為極為活躍的研究領域。激光生物工程的崛起與離子束注入技術的發展，將有力推動植物基因工程在育種上的應用，使誘變育種工作提高到一個新的階段。

1　激光生物工程技術

1.1　激光微束技術　利用激光亮度高、光譜純、可調諧、發散角小等其它光源沒有的特點，將激光束用光學系統加以聚焦，形成非常細的光束，光斑直徑小到幾微米，甚至十分之幾微米，稱為激光微束。激光微束在細胞內聚焦，不破壞細胞膜，卻能對細胞核和細胞器進行操作，如可去掉細胞壁，進行細胞融合、切割染色體等，因此被認為是光刀。60年代末，Berns等開始用激光微束進行了一系列研究，1970年證明激光微束可誘發染色體畸變。中國科學院遺傳研究所也進行了大量工作：胡應和（1982）等用激光誘發微核仁的形成，梁宏等用激光微束引起核仁缺失，得到具有單核仁的細胞，成功率在50%以上。近幾年國內外的研究趨勢是激光微束在高等植物特別是農作物上的應用。我國的梁宏、陸仲康等以農作物種子根尖細胞為材料，首先報道了用激光微束切割高等植物的染色體，成功地把蠶豆、小麥、玉米和大麥染色體切割成4～12片段。并且建立了激光切割植物染色體的實驗技術，為進一步把這一技術方法應用于植物染色體工程、基因定位及植物染色體片斷DNA的微克隆打下了基礎。

1.2　激光細胞融合技術　利用物理或化學的方法將兩個相互接觸的細胞融合為一個細胞的技術稱為細胞融合,是細胞工程的重要內容之一,是一種在細胞水平上的遺傳操縱。若兩個細胞貼在一起,用高峰值功率密度激光對細胞接觸處的質膜進行輻照,質膜發生光擊穿,可產生微米量級的微孔,由于質膜上的微孔是可逆的,質膜分子在重組過程中借助細胞連接處小孔的表面曲率很高，處于高張力狀態，細胞逐漸由啞玲狀變為圓球狀，細胞就融合了。1987年Wiegand等報道了激光誘導油菜原生質體融合的結果，1992年中國科學院大連化學物理研究院等試用金盞菊葉肉細胞原生質體探索激光誘導植物體細胞融合的方法，取得了初步成功。激光細胞融合法與其它化學物理方法相比較具有許多優點：（1）能選擇任意兩個細胞之間進行融合；（2）因僅在兩個細胞的接觸點照射激光，故作用于細胞的應力和障礙小;（3）可進行非接觸、安全且遠距離的無菌操作；（4）能適時觀察融合過程。

1.3　激光導入外源基因　利用人工方法從一種生物中提取某種基因，注入到另一種生物細胞內，并被細胞接受，經培育生長而具有預期的變異性狀的一種生物，此種技術稱為外源基因轉移技術。1987年聯邦德國的Weber報道了用激光微束單脈沖照射將DNA直接導入油菜細胞和葉綠體。中科院王蘭嵐等人及清華大學沈子威等廣泛地選用了不同科屬植物及不同種的植物進行外源基因導入，研究結果表明，激光微束轉化法可廣泛應用于各種植物，而且對細胞的損傷小，轉化頻率高，實驗程序簡便，重復性好，并能準確地定位于被照射細胞，對不同種的植物細胞可通過控制脈沖次數來調節能量。經激光微束處理的細胞可不加抑菌的抗生素以免除對細胞的損傷。1993年王蘭嵐等人又報道了利用微束激光將外源基因導入小麥幼胚并獲得轉基因植株。被認為是世界首例。1995年美國貝克曼激光研究所也報道了將外源基因成功地轉入水稻而培育成基因工程植株。此外，對細胞中的葉綠體打孔，將DNA導入細胞器中也成為一種實用技術。利用激光給油菜的離體葉綠體打開一個臨時性小孔，可將外源DNA整合到此細胞器中并被吸收，基因能在處理過的細胞或細胞器上表達。激光微束法導入外源基因的成功，為高等植物特別是重要糧食作物的遺傳轉化開辟了一條新途徑。

2　離子束注入技術

　　離子束注入生物學效應是我國科技人員于80年代中期發現并迅速投入誘變育種應用的新研究領域。離子束注入種子，誘變后種子損傷輕，突變率高，突變譜廣，有助于培育高產、優質、多抗的新品種。由于離子束注入具有高激發性、劑量集中和可控性，可進行定向誘變，已成為當代植物改良和作物育種的一種新的重要手段。

2.1　作用機理　能量為幾十至幾百KeV的荷能離子通過發生器注入生物體內，在其到達終位前，使同靶材料中的分子原子發生一系列的碰撞。它們之間相互作用的過程隨著離子能量逐漸降低而變化。起初以非彈性碰撞過程為主，使生物分子電離或激發導致電離損傷。隨之彈性碰撞起主要作用，導致靶原子移位，留下斷鏈或缺陷。當入射離子能量損失達到峰值，慢化的原初離子將以高斯分布的形式沉積下來。如果注入離子是活性離子，則它們在沉積過程中將不斷與生物分子鍵合、置換，形成新的分子基團。伴隨著入射離子的能量沉積，其中一小部分能量將隨著動量方向到達表面，引起生物體表面的二次離子發射，即濺射。特別指出的是在離子注入與生物體相互作用的峰值范圍內其相互作用是局部的，雙重的和不易修復的。因此，離子注入用于作物誘變有可能在損傷輕的情況下獲得較高的突變率和較寬的突變譜。

2．2　生物學效應及育種研究　離子束注入具有顯著的生物效應。在各種植物處理中不僅可以發現染色體結構變異，而且發現了三級和四級連續易位等高級結構變異。染色體畸變類型和頻率與注入離子種類、劑量以及生物體部位有關。離子束注入引起細胞壁剝離，細胞排列紊亂，形狀變化巨大，細胞被拉長、扭曲和絞鏈，細胞間質基本上被蝕，留下很深的溝槽和孔洞。離子注入可引起生物體多種生理變化損傷，如導致葉綠體畸變，引起呼吸代謝、過氧化物酶、自由基以及自由基清除酶等的變化。

　　目前，離子束注入植物品種改良已涉及幾乎所有主要的糧食和經濟作物。據悉，已育成的兩個水稻新品種晚D9055和S9042米質優、抗性好，1994年累計推廣應用3多萬hm2，鄭冬官等利用離子束注入棉花種子，選育出4個高產、優質、抗病蟲和早熟新品系，其中一個早熟新品系已經進入省級區試。吳躍進等把離子束注入溫敏型水稻的當代，選育出黃花葉水稻突變體。蔡得田等利用N+離子注入水稻無融合生殖材料，使后代無融合生殖率從14%提高到48%，獲得了高頻無融合生殖水稻HDAR001。安徽農業大學利用離子束處理玉米種子獲得了高光效的多穗型材料，為玉米高產育種提供了一種珍貴的基因資源。1990年以來，安徽農科院等利用離子束介導的植物轉基因技術已將Gus基因導入水稻和棉花帶壁細胞，并將外源赤霉素抗性基因（hph）導入水稻種胚細胞，獲得了轉基因植株。低能離子束介導外源基因轉移直接利用種子胚做外植體，省去了原生質體制備和再生植株的麻煩，便于大量操作和取材，為植物，尤其是農作物基因工程注入了新的活力。

　　此外，利用空間條件引起植物遺傳性變異的空間誘變手段也正處于積極的研究探索階段，也已顯露出誘人的前景。上述的幾種物理誘變新技術實驗驗證與育種應用之間的周期大為縮短，是現代科學技術發展的結果。然而，這些誘變手段的應用與研究還剛剛起步，能否高效率誘變出使用傳統因素難以獲得的突變體或迄今自然界罕見的種質材料，最終成為新的誘變源和誘變因素，有待于在理論機制方面進一步驗證，在育種實踐中進一步探索。隨著科學的發展和各學科的互相滲透，這些新的誘變手段將不斷完善和發展，為農業增產作出貢獻。