草菇DNA提取方法初探

江玉姬， 謝寶貴， 陳文校

(福建農業大學土地與環境學系微生物教研室，福建　福州　350002)

摘　要：研究了3種DNA提取方法對草菇DNA提取的影響。結果表明，CTAB提取法DNA產量高，多糖和蛋白質含量低，符合分子生物學研究要求；氯化芐提取法DNA產量最高，蛋白質含量較低， 但多糖含量高，需要進一步去除；原生質體提取法DNA產量極低，而且蛋白質含量也較高，不適合于草菇DNA提取。

關鍵詞：草菇；DNA提取方法

中圖分類號：Q 89；S 646.13　　文獻標識碼：A

Ways of extracting DNA from Volvariella volvacea

　　 JIANG Yu-ji,XIE Bao-gui,CHEN Wen-xiao

(Department of Land and Environmental Science,Fujian Agricultural University,

Fuzhou 350002,China)

Abstract：Three different ways of extracting Volvariella volvacea DNA was studied.The result showed that the way of using Benzyl chloride got high yield of DNA and low concentration of protein but polysaccharide was higher; The way of using CTAB got a good yield of DNA and low concentration of polysaccharide and protein.It was a good way for extracting Volvariella volvacea DNA.The way of using protoplast got very poor yield of DNA.

Key words：Volvariella volvacea;DNA extraction

　　草菇為初級同宗結合的食用菌，具有復雜的生活史，這給草菇的遺傳學研究和雜交育種等帶來了極大的困難,約束了草菇新優高產品種的篩選。本文試用了幾種不同的DNA提取法，對草菇DNA的提取方法進行了初步研究，尋找一種快速、簡便的DNA提取法，以便于進一步研究草菇的分子生物學特性。

1　材料與方法

1.1　菌株　草菇NO.1菌株由福建農業大學地環系微生物教研室提供。

1.2　供試培養基　PDA培養基： 馬鈴薯200 g、 葡萄糖20 g、KH2PO4 1.0 g、MgSO4 0.5 g、瓊脂20 g、水1 000 ml；去瓊脂為液體培養基。

1.3　菌絲體獲得　菌絲體培養：將適齡的斜面菌種耙棄氣生菌絲并用接種耙切碎培養基，耙入裝有適量玻璃珠及50 ml無菌水的三角瓶中，振蕩打碎培養基制成菌懸液，然后接入裝有100 ml液體培養基的250 ml三角瓶中，每瓶接種10 ml。35℃靜置培養48 h。

　　菌絲體過濾：將液體培養物用65目銅網過濾， 無菌水洗滌過濾2次，0.4 mol.L-1 KCl洗滌過濾，濾紙吸干水分，收集菌絲體。

1.4　主要化學試劑　氯化芐（分析純），上海化學試劑總廠所屬上海試劑二廠生產；CTAB (十六烷基三甲基溴化銨，分析純），上海化學試劑站中心化工廠生產；EDTA（乙二胺四乙酸二鈉， 分析純），廣東汕頭金砂化工廠生產；SDS（十二烷基磺酸鈉)，上海化學試劑采購供應站分裝廠；Tris (三羥甲基氨基甲烷，生化試劑），上海化學試劑采購供應站分裝廠；氯仿（分析純），上海試劑一廠生產；異戊醇（分析純），上海試劑一廠生產。

1.5　DNA提取方法

1.5.1　氯化芐法　參照朱衡等［1］描述的方法，稱取4 g菌絲體，加20 ml提取液(0.1 mol.L-1 Tris.HCl,pH 9.0;0.04 mol.L-1 EDTA,pH 8.0)，振蕩使之與菌體充分混均，再加入4 ml 10% SDS、12 ml氯化芐， 劇烈振蕩，使管內混合物呈乳狀。50℃水浴1 h，每隔10 min振蕩1次，然后加入12 ml的3 mol.L-1 NaOAc混勻，冰浴15 min，4 000 r.min-1離心15 min，取上清液，加入等體積異丙醇，振蕩混合均勻后分裝于10 ml離心管中，室溫沉淀20 min，這時可見絮狀沉淀出現。4 000 r.min-1離心15 min，收集沉淀，用適量70%酒精洗1次，4 000 r.min-1離心15 min，棄上清液，收集沉淀。

1.5.2　CTAB法　參照Borroso［2］描述的方法，取4 g 菌絲體放入冰箱中凍結，然后置于研磨缽中研磨成漿，轉入10 ml的離心管中，加入2.8 ml提取緩液(0.01 mol.L-1 Tris.HCl,pH 8.0;2% CTAB，w/v; 0.02 mol.L-1 EDTA；1.4 mol.L-1 NaCl；2%巰基乙醇，v/v），50℃水浴20 min，加入2.8 ml氯仿－異戊醇混合液(24/1, v/v)，振蕩均勻形成乳濁液，分裝于2支10 ml離心管中，4 000 r.min-1離心30 min，收集上清液，加入4 ml沉淀緩沖液(0.05 mol.L-1 Tris.HCl, pH 8.0;1% CTAB，w/v；0.01 mol.L-1 EDTA)混合均勻，置室溫沉淀30 min。然后在4 000 r.min-1離心15 min，收集沉淀，倒置離心管瀝干。將沉淀物懸浮于2 ml 1 mol.L-1 NaCl中，并加2倍體積冷凍無水乙醇，置冰箱中沉淀30 min。4 000 r.min-1離心15 min，收集沉淀，用10 ml 70%酒精洗滌并于4 000 r.min-1離心15 min，重復3次，制得DNA沉淀。

1.5.3　原生質體法　按照呂作舟等［3］描述的方法制備原生質體，然后加入1 ml TE(0.01 mol.L-1 Tris.HCL,pH 8.0;0.01 mol.L-1 EDTA)(4℃)，混合均勻后再加4～8 ml裂解緩沖液(0.01 mol.L-1 Tris.HCl,pH 8.0;0.01 mol.L-1 EDTA;0.15 mol.L-1 NaCl;0.4% SDS，w/v)，55℃恒溫水浴裂解3～4 h(間隔搖動3～4次)；加等體積SS－酚抽提1次，4 000 r.min-1離心10 min，取上清液；加等體積SS-酚/氯仿/異戊醇(25/24/1，v/v/v)抽提1次，4 000 r.min-1離心10 min得上清液；再用等體積氯仿/異戊醇抽提1次，同上述條件離心得上清液；加5 mol.L-1 NaCl至終濃度為0.1 mol.L-1，混合均勻后加2倍體積無水乙醇(4℃預冷) ，置－20℃冰箱中過夜沉淀DNA；然后在4 000 r.min-1離心10 min，用70%酒精洗滌沉淀(莫攪動)，抽干酒精。

1.6　DNA測定　將3種方法收集的DNA沉淀分別溶于5 ml TE (0.01 mol.L-1 Tris.HCl,pH 8.0; 0.01 mol.L-1 EDTA)，取1 ml加4 ml TE(同上)在紫外分光光度計下掃描(200～400 nm)，得吸收曲線，讀OD230、OD260、OD280的值 ，計算DNA總量、OD260∶230、OD260∶280。

2　結果與分析

　　紫外分光光度計掃描結果見表1,圖1～3。

圖1　氯化芐法提取DNA

Fig.1　The DNA extraction by using Benzyl chloride

圖2　CTAB法提取DNA

Fig.2　The DNA extraction by using CTAB

圖3　原生質體法提取DNA

Fig.3　The DNA extraction through protoplast way

　　表1　3種提取方法的DNA測定結果

　Table 1　 Analysis results of DNAs extracted by different ways

--------------------------------------------------------------------------------------

提取方法 OD230 OD260 OD280 OD260∶230 OD260∶280 DNA總量

(μg)

氯化芐法 0.3680 0.3343 0.1891 0.91 1.77 417.88

CTAB法 0.1461 0.2517 0.1190 1.72 2.12 314.63

原生質體法 -0.000 0.0270 0.0180 1.50 33.75

---------------------------------------------------------------------------------------

　　試驗結果表明，CTAB提取法產量高，多糖和蛋白質含量低，符合分子生物學研究要求；氯化芐提取法產量最高，蛋白質含量較低，但多糖含量高，需要進一步去除；原生質體提取法DNA產量極低，而且蛋白質含量也較高，不適合于草菇DNA提取。

［參考文獻］

［1］朱衡,瞿峰,朱立煌.利用氯化芐提取適合分子生物學分析的真菌DNA［J］.真菌學報，1994，13(1):34-40.

［2］ Borroso G,Perennes D，Labarere J.A miniprep method for RFLP analysis and dsRNAS detectiond perfected in the cutivated fungus Agrocybe aegerita［C］.Science and Cultivation of Edible Fungi,1995，87-94.

［3］ 呂作舟.食用真菌基因工程實驗技術［J］.中國食用菌，1992,11(1):13.