菌種是從食用菌子實體的孢子或組織體的菌絲或基質的菌絲體分離得到的。分離得到的菌種叫母種，故菌種分離也叫母種分離。
一、種菇的選擇：選擇出菇早，菇型好，個頭符合商品標準并且均勻，生長健壯。產量高，無病蟲害，八成熟的子實體。
二、分離方法：通過無菌操作進行孢子分離法、組織分離法、基質分離法等。
1. 孢子分離法：取八成熟的良好種菇，去雜物，用75%酒精抹擦菇體，去除菇柄，放入滅菌的器皿內備用。用一個頂部有孔口的玻璃罩，罩下放一張干凈的白紙，白紙上放一培養皿，皿口向上。取一鐵絲、雙層紗布、棉塞備用。以上物品放在一白瓷盆內，物品全部經滅菌處理。把種菇用鐵絲鉤著菇蓋，菌褶向著培養皿，掛在罩頂的孔，菇體在罩內稍接近培養皿為宜。用棉塞、紗布把罩孔封好。連白瓷盆一起在適溫漫射光條件下培養12—20小時。孢子散出，用接種針或接種環取單孢或少數幾個孢子在斜面或平板培養基上劃線分離，要求無菌操作。把接種的培養基在適溫、黑暗條件下培養3—4天可得純培養菌絲體。孢子分離法還有褶抹法、鉤懸法、粘附法。
2. 組織分離法：選擇優良種菇，去雜，用75%酒精抹擦菌體，稍干，再用0.1%氯化汞抹擦菌體，用解剖刀從菇體底部輕輕縱向切一刀，然后用手把菇掰開。用解剖刀在菇柄與菇蓋之間或菇柄上部挑取0.2立方厘米的小塊組織，放入適當的斜面或平板培養基上，在適溫、黑暗中培養3—4天，長出白色菌絲體即可，以上全部無菌操作。組織分離法還有菌核分離法、菌索分離法等。
3. 基質分離：以菇木或耳木為例介紹。基質是生育食用菌的木材。在產子實體的季節，選擇出菇良好，無病蟲害的菇木晾干，截取2厘米長的小段，放在0.1%氯化汞中浸1分鐘，再用無菌水沖洗2—3次，吸干水分。用解剖刀把木段四周切去，再把木段切成火柴枝大小的木枝，每木枝去兩頭，插入或平放在平板培養基內，在適當條件下3—5天長出菌絲體，即得母種，以上必須無菌操作。基質分離還有土壤分離法、培養料分離法等。（華南農業大學 梁志慧）
