藥用真菌Cv優質菌株誘變育種和營養條件的初步研究

盛麗君

摘要：將Cv出發菌株進行紫外誘變處理，以生長速度為指標進行初篩，結果在37株誘變株中選出8株生長速度較快的菌株，進一步通過深層發酵培養進行復篩，分析這8株初篩誘變株的菌絲體生物量和胞內多糖產量，胞內多糖得率最高的菌株分別是Cv-2和Cv-5，但考慮到Cv-2的菌絲體干重明顯小于Cv-5，故選Cv- 5為優選菌株。研究不同碳、氮源對誘變株Cv-5菌絲體生物量和胞內多糖產量的影響，認為玉米粉、淀粉是較好的碳源，黃豆餅粉、硝酸鉀是較好的氮源。對碳、氮源和無機鹽的主要影響因素進行正交試驗以及均勻試驗后，確定最有利于菌絲體生長的培養基的最佳配比為：玉米粉2.5% 、黃豆餅粉1.0% 、硝酸鉀0.3% 、MgSO4 ? 7H20 1.3%、KH2PO4 1.3%，菌絲體生長量達1225.0mg/100ml。最適宜胞內多糖合成的培養基的最佳配比為：玉米粉2.5% 、黃豆餅粉1 .0% 、硝酸鉀0.3% 、MgSO4?7H20 0.3%、KH2PO4 1.1%，胞內多糖產量可達99.0mg/100ml。

關鍵詞：Coriolus vesicolor；紫外誘變；碳氮源試驗

A Preliminary Study on the Breeding and Nutrition Condition

Of Coriolus vesicolor

Abstract: Coriolus vesicolor was treated with uv-irradiation, and 8 strains were selected by comparing their mycelial growing speeds from 37 strains. After submerged cultivated, those 8 strains were analyzed about their mycelial growth and intracellular polysaccharides. The results showed that No.5 was better in mycelial growth and intracellular polysaccharides production. After the effects of different carbon and nitrogen sources on mycelial growth and intracellular polysaccharides were studied, it was found that corn powder、starch、bean meal、Potassium Nitrate were the better carbon and nitrogen sources for the mycelial growth and intracellular polysaccharides. After the orthogonal test and the uniform design, the best composition of medium for the mycelial growth was thought as 2.5% corn powder、1.0% bean meal、0.3% Potassium Nitrate、1.3% MgSO4?7H20、1.3% KH2PO4 , the output of mycelial growth was 1225.0mg/100ml. The best composition of medium for intracellular polysaccharides was thought as 2.5% corn powder、1.0% bean meal、 0.3% Potassium Nitrate、0.3% MgSO4?7H20、1.1% KH2PO4 ，the output of intracellular polysaccharides was 99.0mg/100ml.

Key words: Coriolus vesicolor ; uv-irradiation; carbon and nitrogen test

0 引言

真菌不但是我國天然藥物資源和中草藥的一個極為重要的組成部分，而且已成為當今探索和發掘抗癌藥物的重要領域。自從1951年美國人Reilly H 首次發現擔子菌有抑癌活性以來，特別是日本學者千原于1969年報道了香菇抗腫瘤多糖之后，在全球范圍內掀起了一場從食藥用真菌中尋找抗癌藥物的熱潮，迄今為止已證明100多種真菌具有顯著的抗腫瘤活性[1-6]。已研究開發的真菌多糖產品有：香菇多糖、靈芝多糖、云芝多糖、金針菇多糖、竹蓀多糖等[1-9]。

云芝又稱彩色云芝、采絨革蓋菌(Coriolus vesicolor)，隸屬于靈芝科，已報道有日本的“PSK”[10]、中國的“PSP”、云芝多糖、云星等多種產品上市，它們不僅給腫瘤患者帶來了福音，也給生產廠家帶來了巨大的經濟效益和社會效益。

優質菌種是產品研發的基本前提。常見的擔子菌菌種選育方法有自然選育、誘變育種、雜交育種等[11-13]，近幾年來利用原生質體融合技術和基因工程技術改造菌種的方法也取得了較大的進展，但誘變育種仍是一個有效的方法[14-19]。在紫外線誘變育種的過程中，最適宜的誘變對象是單細胞、單核的個體，但擔子菌孢子的獲得往往受到季節的限制。因此對于不易獲得孢子或孢子不易萌發的菌種，可對其菌絲片段進行誘變處理，以獲得優質菌株[20]。

本研究對一株云芝出發菌株進行了紫外誘變育種，以期獲得深層培養時菌體生長量多，胞內多糖產量高的優質菌株。同時還初步研究了其中一株優質菌種的深層發酵營養條件，進一步提高云芝多糖產品的經濟效益，提供優質菌株和最佳的營養條件。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

Cv菌株（Coriolus vesicolor）

1.2 培養基

1.2.1 斜面培養基（PDA培養基）

土豆 20%

蔗糖 2%

瓊脂 2%

pH 自然

1.2.2 液體培養基

1.2.2.1 種子培養基

玉米粉 3%

蔗 糖 1%

麥芽糖 1%

pH 自然

1.2.2.2 發酵培養基

Ⅰ.葡萄糖 3% Ⅱ.葡萄糖 2%

黃豆餅粉 1% 蛋白胨 0.5%

MgSO4 ? 7H20 0.1% MgSO4 ? 7H20 1%

KH2PO4 0.1% KH2PO4 2%

pH 自然 pH 自然

Ⅲ.葡萄糖 2% Ⅳ.玉米粉 2.5%

蛋白胨 0.5% 黃豆餅粉 1.0%

MgSO4 ? 7H20 0.1% 硝酸鉀 0.3%

KH2PO4 0.2% MgSO4 ? 7H20 0.1%

pH 自然 KH2PO4 0.1%

pH 自然

1.2.2.3 碳源試驗培養基

以發酵培養基Ⅱ為基礎，將2%葡萄糖分別替換成：檸檬酸、甘油、蔗糖 、麥芽糖、糊精、淀粉、玉米粉7種碳源進行試驗。

1.2.2.4 氮源試驗培養基

以發酵培養基Ⅲ為基礎，將0.5%蛋白胨分別替換成：牛肉浸膏、酵母粉、麩皮、黃豆餅粉、硫酸銨、硝酸鉀6種氮源進行試驗。

1.3 培養條件

1.3.1 斜面培養

從原始Cv菌株的斜面中取出約0.5cm2大小的一塊菌絲體接種于PDA斜面上，28℃恒溫培養5d左右。

1.3.2 液體培養

1.3.2.1 種子培養

將斜面菌種接種于種子培養基后，于28±1℃，140±10rpm的恒溫振蕩培養器中培養2d。

1.3.2.2 發酵培養

將種子培養物接于發酵培養基中，于28±1℃，140±10rpm的恒溫振蕩培養器中培養5-6d。

1.4 紫外誘變育種

1.4.1 紫外誘變

在無菌條件下，刮取已活化的菌絲體片段，用2ml的生理鹽水洗滌斜面，制成菌絲體懸液，用脫脂棉過濾于裝有玻璃珠的錐形瓶中，28±1℃，140±10rpm 搖床上振搖30min后，將菌絲體懸液置于15W紫外燈下30cm處，分別用1″、10″、40″、1′、2′的劑量進行紫外誘變。誘變后的菌液進行梯度稀釋后，用移液管吸取適量體積，涂布PDA平皿，28℃避光培養3d后觀察結果并記錄。

1.4.2 菌株篩選

紫外誘變后，將PDA平皿上直徑大，菌絲生長茂盛的菌落轉接于PDA斜面中，28℃避光培養，7d后觀察并記錄各菌絲體的生長長度。將初篩出的生長速度較快的誘變株分別接種于液體發酵培養基Ⅰ中，28±1℃，140±10rpm的恒溫振蕩培養器中培養6d，分析各誘變菌株的菌絲體生長量和胞內多糖產量。

1.5 分析方法

1.5.1 菌絲體干重

振蕩培養后的發酵液抽濾后，獲菌絲體和濾液，菌絲體用蒸餾水洗滌抽濾3次后于60℃烘箱烘干至恒重，稱得菌絲體干重。

1.5.2 胞內多糖測定

將菌絲體研磨成細粉，加入20ml蒸餾水，95±2℃下水浴浸提3小時后，加入4倍體積的95%乙醇，置于4℃冰箱過夜，4000r/min離心10分鐘，棄上清液，沉淀物于60℃烘箱烘干至恒重，稱重即為胞內多糖。

1.5.3 多糖得率

多糖得率（%）= 胞內多糖干重/菌絲體干重×100%

1．6 營養條件試驗

1.6.1 碳氮源試驗

將發酵培養基Ⅱ中的碳源分別替換成2%檸檬酸、甘油、葡萄糖、蔗糖 、麥芽糖、糊精、淀粉、玉米粉，接10%種子培養物，每種碳源作3次重復。28±1℃，140±10rpm振蕩培養6d后，測量并比較8種碳素營養對菌絲體干重、胞內多糖產量的影響。

將發酵培養基Ⅲ中的0.5%氮源分別換成蛋白胨、牛肉浸膏、酵母粉、麩皮、黃豆餅粉、硫酸銨、 硝酸鉀，接10%種子培養物，每種氮源作3次重復。28±1℃，140±10rpm振蕩培養5d后測量并比較7種氮素營養對菌絲體干重、胞內多糖產量的影響。

1.6.2 碳氮源的正交試驗

將碳氮源單因子試驗中，菌絲體生長量大，胞內多糖產量高的4種碳氮源進行L9（34）的9組正交試驗，28±1℃，140±10rpm振蕩培養6d后，測量并比較各種不同碳氮源因子對菌絲體干重、胞內多糖產量的影響。

1.6.3 無機鹽試驗

對發酵培養基Ⅴ中的MgSO4 ? 7H20 、KH2PO4 進行U7（72）的7組均勻試驗，28±1℃，140±10rpm振蕩培養6d后，測量并比較各種不同無機鹽因子對菌絲體干重、胞內多糖產量的影響。

2 結果與討論

2.1 Cv出發菌株的誘變育種

2.1 .1 紫外誘變

活化培養后的菌絲片段分別用1″、10″、40″、1′、2′的劑量進行紫外誘變，誘變后的菌液經梯度稀釋后涂布PDA平皿，28℃避光培養3d后，進行菌落記數。結果見圖1。

圖1 紫外照射對Cv菌株的影響

從圖1可見：隨著紫外照射劑量的增加，菌株的致死率逐漸升高，到2分鐘時已達96.65%。

2.1.2 Cv誘變菌株的初篩

當處理劑量大時，殺菌率高（90～99%），在單位存活細胞中負突變菌株多，正突變菌株少。用小劑量進行誘變處理時，殺菌率約為50～80%，在單位存活細胞中正突變株多[21]。所以選取紫外照射1′的誘變菌株（致死率為85.82%）直徑大，菌絲生長茂盛的菌落轉接于PDA斜面中，28℃避光培養7d后，測量菌絲體生長長度。結果見表1。

表1 Cv誘變株的初篩試驗

菌株 Strains 菌絲體生長長度 （mm） 平均長度 （mm） 日生長速度 （mm/d） 差值 (mm)

出發菌株 45 45 45.0 6.43 0.00

1 53 50 51.5 7.36 0.93

2 55 55 55.0 7.86 1.43

3 50 50 50.0 7.14 0.71

4 52 44 48.0 6.86 0.43

5 55 55 55.0 7.86 1.43

6 52 56 54.0 7.71 1.28

7 47 47 47.0 6.71 0.28

8 52 52 52.0 7.43 1.00

9 46 46 46.0 6.57 0.14

10 54 55 54.5 7.79 1.36

11 40 40 40.0 5.71

12 34 38 36.0 5.14

13 53 56 54.5 7.79 1.36

14 38 45 41.5 5.93

15 55 55 55.0 7.86 1.43

16 55 55 55.0 7.86 1.43

17 45 40 42.5 6.07

18 40 43 41.5 5.93

19 54 54 54.0 7.71 1.28

20 30 30 30.0 4.29

21 48 48 48.0 6.86 0.43

22 55 55 55.0 7.86 1.43

23 44 46 45.0 6.43 0.00

24 52 52 52.0 7.43 1.00

25 20 20 20.0 2.86

26 30 42 36.0 5.14

27 52 52 52.0 7.43 1.00

28 48 48 48.0 6.86 0.43

29 48 50 49.0 7.00 0.57

30 43 43 43.0 6.14

31 42 42 42.0 6.00

32 53 55 54.0 7.71 1.28

33 55 55 55.0 7.86 1.43

34 53 52 52.5 7.50 1.07

35 52 50 51.0 7.29 0.86

36 43 43 43.0 6.14

37 42 42 42.0 6.00

由表1可知：在37株誘變株中，Cv-1、Cv-2、Cv-3、Cv-4、Cv-5、Cv-6、Cv-7、Cv-8、Cv-9、Cv-10、Cv-13、Cv-15、Cv-16、Cv-19、Cv-21、Cv-22、Cv-23、Cv-24、Cv-27、Cv-28、Cv-29、Cv-32、Cv-33、Cv-34和Cv-35這25株誘變株的生長速度大于出發菌株。

對初篩試驗的實驗數據作極差分析，結果見表2：

表2 Cv-xi誘變株生長速度頻數分布表

組限 組中值（xc） 頻數（f）

(A)1.62～1.35 1.485 8

(B)1.34～1.08 1.215 3

(C)1.07～0.81 0.945 6

(D)0.80～0.54 0.675 2

(E)0.53～0.27 0.405 4

(F)0.26～0.00 0.135 2

極差分析表明：A組中8個誘變菌株Cv-2、Cv-5、Cv-10、Cv-13、Cv-15、Cv-16、Cv-22、Cv-33與Cv出發菌株的菌絲體生長速度差值最大，菌絲體生長速度明顯高于出發菌株。

2.1.3 Cv誘變菌株的復篩

將生長速度最快的誘變菌株Cv-2、Cv-5、Cv-10、Cv-13、Cv-15、Cv-16、Cv-22、Cv-33，分別接種于發酵培養基Ⅰ中振蕩培養6d后，比較它們的菌絲體生長量和胞內多糖產量。結果見表3。

表3 Cv誘變株的復篩試驗

菌株 Strains 菌絲體干重 （mg/100ml） 胞內多糖 （mg/100ml） 得率 （%）

出發菌株 1176.50 89.00 7.56

2 427.00 172.25 40.34

5 667.50 163.25 24.46

10 746.00 63.50 8.51

13 1210.00 108.25 8.95

15 1046.00 54.25 5.20

16 972.50 55.00 5.66

22 1228.00 67.25 5.48

33 1088.50 107.50 9.88

由表3可知：8個誘變株經深層培養后，誘變株Cv-13、Cv-22比出發菌株的菌絲體生長量高。從胞內多糖的產量來看，誘變株Cv-2、Cv-5、Cv-13、Cv-33與出發菌株相比有不同程度的提高，其中Cv-2的胞內多糖產量最高，為出發菌株的1.9倍；Cv-5的胞內多糖產量位于第二，為出發菌株的1.8倍。從胞內多糖的得率來看，誘變株Cv-2、Cv-5、Cv-10、Cv-13、Cv-33得率與出發菌株相比有不同程度的提高，其中Cv-2、Cv-5得率明顯高于出發菌株。綜合考慮，選取Cv-5作為深層發酵的優選菌株。

2.2 誘變株Cv-5的營養條件試驗

2.2.1 碳源對菌絲體生長量和胞內多糖產量的影響

碳源是微生物培養基的一個重要成分，它主要用于合成細胞碳素物質，為細胞的生命活動提供能量[11]。對Cv-5優選菌株進行深層發酵培養，研究不同碳源對菌絲體生長和胞內多糖產量的影響。本實驗選用檸檬酸、甘油、葡萄糖、蔗糖 、麥芽糖、糊精、淀粉、玉米粉8種不同的碳源進行發酵培養，比較這幾種碳源對菌絲體生長量和胞內多糖產量的影響。結果見表4。

表4 幾種碳源對菌絲體生長和胞內多糖產量的影響

碳源 菌絲體干重 （mg/100ml） 胞內多糖 （mg/100ml） 得率 （%）

檸檬酸 70.50 8.50 12.06

甘油 803.50 30.33 3.77

葡萄糖 792.50 18.83 2.38

蔗糖 811.00 32.33 3.99

麥芽糖 816.50 22.83 2.80

糊精 805.50 26.67 3.31

淀粉 818.00 40.17 4.91

玉米粉 1081.00 33.17 3.07

由表4可知：供試菌株在這幾種碳源中均能生長，并能合成胞內多糖，但不同碳源對菌絲體生長及胞內多糖產量的影響有差異。當碳源為玉米粉時，誘變株Cv-5的菌絲體生長產量最多，為1081.00mg/100ml，其次是淀粉，為818.00mg/100ml。而最利于胞內多糖合成的碳源為淀粉，誘變株Cv-5的胞內多糖產量可達40.17mg/100ml，其次是玉米粉，為33.17 mg/100ml。另外，當碳源為檸檬酸時，胞內多糖得率最高，為12.06 %，與位于第二的4.91 %(淀粉為碳源)相差較大，但碳源為檸檬酸時，菌絲體生長產量最少，可見檸檬酸不利于誘變株Cv-5的生長，而且作為發酵碳源成本較高。從成本、菌絲體生長量、胞內多糖產量等因素綜合考慮，誘變株Cv-5最適宜碳源為玉米粉、淀粉。

2.2.2 氮源對菌絲生長與胞內多糖產量的影響

氮源主要用于構成菌絲體細胞物質和含氮的目的產物[11]。本實驗選用有機氮源蛋白胨、牛肉浸膏、酵母粉、麩皮、黃豆餅粉和硫酸銨、 硝酸鉀等無機氮源進行深層發酵試驗，研究不同氮源對菌絲體生長和胞內多糖產量的影響。結果見表5。

表5 幾種氮源對菌株的菌絲體生長與胞內多糖產量的影響

氮源 菌絲體干重 （mg/100ml） 胞內多糖 （mg/100ml） 得率 （%）

蛋白胨 442.50 14.00 3.16

牛肉浸膏 473.00 10.33 2.18

酵母粉 415.00 9.00 2.17

麩皮 335.00 18.67 5.57

黃豆餅粉 441.50 16.33 3.70

硫酸銨 237.50 3.33 1.40

硝酸鉀 714.00 31.67 4.44

由表5可知：當氮源為硝酸鉀時，誘變株CV-5的菌絲體生長產量最多，為714.00mg/100ml，其次是牛肉浸膏，為473.00mg/100ml。而最適宜胞內多糖合成的氮源是硝酸鉀、麩皮和黃豆餅粉，產量分別31.67mg/100ml 、18.67mg/100ml和16.33mg/100ml。另外，當氮源為麩皮、硝酸鉀和黃豆餅粉時，胞內多糖得率分別是5.57%、4.44%和3.70%。從菌絲體生長量、胞內多糖產量兩因素考慮，認為硝酸鉀、麩皮、黃豆餅粉是有利于誘變株CV-5菌絲體生長和胞內產多糖的氮源；從成本、菌絲體生長量、胞內多糖產量等因素綜合考慮，認為硝酸鉀、黃豆餅粉是有利于誘變株CV-5菌絲體生長和胞內產多糖的氮源。

2.2.3 碳氮源的正交試驗

單因子實驗結果表明，碳、氮源中玉米粉、淀粉、黃豆餅粉、硝酸鉀對誘變株Cv-5的菌絲體生長量及胞內多糖產量影響最大。為考慮這些因子協同作用，并確定其最佳組成及配比，選用玉米粉、淀粉、黃豆餅粉、硝酸鉀四因子，各取3個水平L9（34）進行正交試驗。實驗設計及分析結果見表6、表7。

表6 正交實驗因子水平表

因子 玉米粉 淀粉 黃豆餅粉 硝酸鉀

水平 A（%） B（%） C（%） D（%）

1 1.5 0.0 0.5 0.0

2 2.0 1.0 1.0 0.3

3 2.5 1.5 1.5 0.5

表7 正交實驗結果的極差分析

因素 實驗號 A B C D 菌絲體干重 (mg/100ml) 胞內多糖干重 （mg/100ml）

1 1（1.5） 1（0.0） 1（0.5） 1（0.0） 759.0000 42.1667

2 1（1.5） 2（1.0） 2（1.0） 2（0.3） 612.0000 67.6667

3 1（1.5） 3（1.5） 3（1.5） 3（0.5） 902.5000 45.5000

4 2（2.0） 1（0.0） 2（1.0） 3（0.5） 744.5000 76.0000

5 2（2.0） 2（1.0） 3（1.5） 1（0.0） 1077.5000 65.0000

6 2（2.0） 3（1.5） 1（0.5） 2（0.3） 607.5000 76.6667

7 3（2.5） 1（0.0） 3（1.5） 2（0.3） 1183.0000 99.3333

8 3（2.5） 2（1.0） 1（0.5） 3（0.5） 603.0000 64.8333

9 3（2.5） 3（1.5） 2（1.0） 1（0.0） 1081.0000 90.0000

K1 菌 K2 體 K3 干 k1 重 k2 k3 R 2273.5000 2429.5000 2867.0000 757.8333 809.8333 955.6667 197.8334 2686.5000 2292.5000 2591.0000 895.5000 764.1667 863.6667 131.3333 1969.5000 2437.5000 3163.0000 656.5000 812.5000 1054.3333 397.8333 2917.5000 2402.5000 2250.0000 972.5000 800.8333 750.0000 222.5000

K1 胞 K2 內 K3 多 k1 糖 k2 干 k3 重 R 155.3334 217.6667 254.1666 51.7778 72.5556 84.7222 32.9444 217.5000 197.5000 212.1667 72.5000 65.8333 70.7222 6.6667 183.6667 233.6667 209.8333 61.2222 77.8889 69.9444 16.6667 197.1667 243.6667 186.3333 65.7222 81.2222 62.1111 19.1111

由表7可知：各試驗因素對菌絲生長的影響程度為 C＞D＞A＞B，即黃豆餅粉是影響菌絲生長的主要因素（R=397.8333），硝酸鉀、玉米粉是次要因素（R=222.5000、197.8334）,淀粉對菌絲生長的影響最小（R=131.3333）。理論上最利于菌絲體生長的培養基組合為 A3 B1 C3 D1 ，即玉米粉2.5% 、黃豆餅粉1.5% 。各試驗因素對胞內多糖的影響程度為 A＞D＞C＞B , 即玉米粉是影響胞內多糖合成的主要因素（R=32.9444），硝酸鉀、黃豆餅粉是次要因素（R=19.1111、16.6667）,淀粉對胞內多糖的影響最小（R=6.6667）。理論上最適宜胞內多糖合成的培養基組成為 A3 B1 C2 D2 ，即玉米粉2.5% 、黃豆餅粉1 .0% 、硝酸鉀0.3% 。

對正交試驗的實驗數據作多元線性回歸分析，結果如下：

a、對菌絲體生物量的回歸分析：

回歸方程式: Y = 201 .15 + 197.83 A - 36.95 B + 397.83 C - 455.04 D

相關系數 R = 0.958 * （ R 0.05 = 0.930 ， R 0.01 = 0.970 ）

說明各因素與菌絲體生物量之間存在著顯著的相關。

標準差 Se = 92.66

F值 11.05

樣本數 N = 9

表8 方差分析表

變異來源 df ss S2 F F0.05 F0.01

回歸 4 379575.37 94893.84 11.05* 6.388 15.98

剩余 4 34346.52 8586.63

總的 8 413921.89

F檢驗顯著,說明回歸方程揭示的規律性強。

b、對胞內多糖產量的回歸分析：

回歸方程式： Y = - 2.581 + 32.94 A - 1.97 B + 8.72 C - 2.57 D

相關系數 R = 0.796

標準差 Se =15.92

F值 1.73

樣本數 N = 9

經方差分析，差異不顯著。

2.2.4 無機鹽對菌絲體生長量和胞內多糖產量的影響

微生物在生長繁殖和合成目的產物的過程中，需要某些無機鹽和微量元素以作為其生理活性物質的組成或生理活性物質合成時的調節物。這些物質一般在低濃度時對微生物生長和目的產物合成有促進作用，在高濃度時常表現出明顯的抑制作用[11]。因此，培養基成分中的無機鹽濃度也是影響微生物生理活性的重要因子。采用均勻試驗的方法，比較MgSO4 ? 7H20和KH2PO4 這兩種無機鹽及不同濃度對菌絲體生長量和胞內多糖產量的影響。設計方案及結果見表9、表10。

表9 均勻試驗因子水平表

水平因子 1 2 3 4 5 6 7

A MgSO4 ? 7H20(%) 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9 1.1 1.3

B KH2PO4 (%) 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9 1.1 1.3

表10 均勻試驗的設計和結果

試驗次數 A B 菌絲干重 （mg/100ml） 胞內多糖干重 （mg/100ml）

1 1(0.1) 3(0.5) 573.0 61.8333

2 2(0.3) 6(1.1) 893.0 99.0000

3 3(0.5) 2(0.3) 718.5 49.1667

4 4(0.7) 5(0.9) 936.5 57.5000

5 5(0.9) 1(0.1) 855.5 82.0000

6 6(1.1) 4(0.7) 715.0 61.6667

7 7(1.3) 7(1.3) 1225.0 92.0000

對均勻試驗的實驗數據作多元線性回歸分析，結果如下：

a、 對菌絲體生物量的回歸分析：

回歸方程式： Y = 400.46 + 310.18 A + 325.18 B

相關系數 R = 0.929 * （ R0.05 = 0.811 ， R0.01 = 0.949 ）

說明各因素與菌絲體生物量之間存在著顯著的相關。

標準差 Se = 94.72

F值 6.41

樣本數 N = 7

表11 方差分析表

變異來源 df ss S2 F F0.05 F0.01

回歸 2 226187.09 113093.55 12.61* 6.944 18.00

剩余 4 35885.34 8971.34

總的 6 262072.43

F檢驗顯著,說明回歸方程揭示的規律性強。

分析回歸方程式，可以看出各項系數均為正值。所以，在考察的配比范圍內，A、B取值越大，菌絲生長情況越好。故優化結果，將A =1.3 , B =1.3 代入回歸方程中得理論上菌絲體生物量的最大值及其波動范圍。

= 1226.43 mg/100ml

Y = U α * Se ( 查表得： U 0.05 =　1.645 )

Y = 1226.43 155.81 mg/100ml

所以，優化結果的菌絲干重的范圍是：1070.62 ～ 1382.24 mg/100ml。

(查表得： U 0.05 =　1.645)

b、對胞內多糖干重回歸分析：

回歸方程式： Y = 191.84 + 42.20 A - 6.06 B

相關系數 R = 0.471 * （ R0.05 = 0.811 ， R0.01 = 0.949 ）

說明各因素與菌絲體生物量之間存在著顯著的相關。

標準差 Se = 42.21

F值 0.57

樣本數 N = 7

經方差分析，差異不顯著。

小結：

1、出發菌株Cv經紫外誘變處理后，選取紫外照射劑量為1′的誘變菌株在PDA斜面上培養，篩選出8個優質菌株。分別是Cv-2、Cv-5、Cv-10、Cv-13、Cv-15、Cv-16、Cv-22、Cv-33。從菌絲體生長量來看，誘變株Cv-22最高，達1228.00mg/100ml ，其次是誘變株Cv-13，達1210.00mg/100ml。從胞內多糖的產量來看，誘變株Cv-2最高，為172.25mg/100ml，其次是誘變株Cv-5，為163.25mg/100ml。本次紫外誘變育種挑選出4個優質菌種，為Cv-2、Cv-5、Cv-13、Cv-33。

2、選取誘變株Cv-5作為進一步深層發酵的優質菌株，該菌株在PDA斜面上生長速度快，達7.86 mm/d，長勢旺盛。在發酵培養基中菌絲體生長量和胞內多糖產量較出發菌株有明顯的提高（菌絲體生長量為667.50mg/100ml，胞內多糖產量為163.25mg/100ml，得率為24.46%）。

3、對優質菌株Cv-5的營養條件進行初步的研究。碳氮源試驗、正交試驗、均勻試驗結果表明，最有利于菌絲體生長的培養基的最佳配比為：玉米粉2.5% 、黃豆餅粉1.0% 、硝酸鉀0.3% 、MgSO4 ? 7H20 1.3%、KH2PO4 1.3%，菌絲體生長量達1225.0mg/100ml。最適宜胞內多糖合成的培養基的最佳配比為：玉米粉2.5% 、黃豆餅粉1 .0% 、硝酸鉀0.3% 、MgSO4?7H20 0.3%、KH2PO4 1.1%，胞內多糖產量可達99.0mg/100ml。

參考文獻： 略