一、食用菌種瓶的選擇
用100毫升醫用鹽水瓶代替試管作盛裝培養基的容器。
二、培養基的配制
1．配方：馬鈴薯200克，葡萄糖20克，瓊脂18～20克，水1000毫升。
2．制作：馬鈴薯挖去芽眼，去皮洗凈，切成薄片后加水，在鋁鍋中煮沸25～30分鐘，用4層紗布過濾，取濾液放入鋁鍋中，加入瓊脂，小火加熱并不斷攪拌，待瓊脂溶化后加入葡萄糖，加開水補足1000毫升，攪勻，趁熱裝入鹽水瓶中，每瓶裝8～10毫升，塞上棉塞 棉塞要求干燥、松緊、長度合適 ，再用牛皮紙包住棉塞及瓶口部分，用膠圈扎緊瓶口。
三、滅菌
采用高壓滅菌，若沒有專用高壓鍋，可用家用高壓鍋進行滅菌。方法是：將裝好培養基的菌種瓶放置在高壓鍋中，瓶間留有空隙，不可堆放過緊，以利蒸汽循環，滅菌徹底。當壓力表指針指到0．05時，打開放氣閥，集中排出冷空氣，使壓力降到零時，關閉排氣閥進行升壓滅菌，自動放氣后保持30分鐘 家用普通高壓鍋滅菌1．5小時 ，讓其自然冷卻，取出放置在接種箱中備用。
四、菌種分離
主要采用組織分離法。通常是從食用菌子實體內部分離純菌種，操作時，從子實體內切取一小塊組織，放在培養基中培養可長出純菌種，且菌絲萌發快，遺傳性狀穩定，后代不易發生變異。
1．種菇消毒：種菇采下后，切去菌柄，放入洗凈的盤內，在裝有紫外燈的接種箱內照射20～30分鐘。
2．接種塊切取：在已消毒的接種箱內，撕開子實體，用經酒精燈火焰殺菌冷卻的小刀，在菌柄與菌蓋交接處內部切取黃豆大小組織塊，放入菌種瓶內培養基上培養。
3．接種塊選擇部位：接種塊選擇部位因食用菌種類不同而異，菇體肥厚的種菇，在菌蓋外緣菌蓋皮和菌褶交接處切取組織塊進行分離。
菌體小、蓋薄、柄空的菌類 如金針菇 ，應快速擊掉菌蓋，用接種針鉤取菌柄頂端生長點組織進行分離。
菌肉極薄菌柄中空孢子不易萌發的傘菌類，可采用子實層分離法，選取半破膜的子實體，移入培養基上，菌絲萌發后即轉入新的培養基上。對子實體較大、質地結實的多孔菌類，應取子實體外緣菌肉組織塊。
含水量低的子實體切取5平方厘米的小塊，在酒精燈火焰上烘烤5～10秒鐘，使子實體表現微焦，然后用無菌刀切取菌肉組織一小塊，移入培養基上。
五、培養及管理
將放入組織塊的菌種瓶豎放在室內架上或平臺上，室內溫度控制在20～28℃，經過1～2天組織塊萌發。菌絲生長期間注意觀察。發現污染及時挑出，經過10天左右菌絲長滿瓶，母種制作成功。
