優質的香菇菌種是獲得高產、高經濟效益的有力保證。菌種制備可經過純種分離、試驗→母種制備→原種制備→栽培種制備→菌種保存等流程。
一、純種分離及出菇試驗：選擇出菇早、出菇均勻、成叢的、朵形好、粗壯肥大、柄短、色澤好、八成成熟的菇體為種菇。用孢子分離法或組織分離法或菇木分離法，用馬鈴薯葡萄糖瓊脂或玉米粉瓊脂培養基進行純種分離，在攝氏22―26度環境中培養，經10―20天長成菌落，挑取色白、健壯、無病蟲害菌絲轉入斜面培養。經2―3次純培養后，并經出菇試驗，選取優良菌株用作制母種。
二、母種制備：取經出菇試驗的純種，用馬鈴薯葡萄糖瓊脂在攝氏24―26度培養。母種可轉3―4代擴大培養。
三、原種制備：把母種用與栽培料接近的培養基進行擴大培養，得原種。原種也可直接用于栽培接種。原種培養基：鋸木屑78%、米糠或麩皮20%、蔗糖1%、硫酸鈣1%、水適量。裝入750毫升菌種瓶，包扎好在1.5公斤壓力下1小時滅菌。接入母種后在攝氏24―26度培養30―40天至菌絲長滿瓶。
四、栽培種制備：栽培種是原種的進一步擴大生產，直接用于栽培接種的，培養基配方及培養條件與原種的相同。也可用木塊作菌種培養基。用1.5―1.8厘米厚、直徑1厘米的圓木粒或楔形木塊1000個，木屑100克，米糠50克，水150―200毫升。先把木粒在水中浸透，再用浸過木粒的水拌料，然后裝入菌種瓶在1.5公斤壓力1小時滅菌后接種培養。
五、菌種要求：香菇菌絲體白色，一部分長入料內，一部分氣生，外觀有彈性。菌絲結塊好，成熟的 菌絲體表面菌絲塊變成茶褐色，有香菇的特殊氣味，無病蟲害，健壯。菌種長至1/3瓶時，可把培養室溫度降低攝氏2―3度，有利菌種的生長。成熟菌種應存放在陰涼、干爽、潔凈的環境中，防止污染和放緩生長，免加速老化。
