金 丹 李寶聚 石延霞 謝學文 《食用菌學報》 2009年第01期
摘 要: 本文將從平菇(Pleurotus ostreatus)褐斑病中分離純化的240多個菌株中,選出使平菇褐斑病發病快且病情嚴重的菌株PG1702,對其進行致病性試驗,結果表明菌株PG1702為引起平菇細菌性褐斑病的病原菌;顯微形態的觀察和擴增出的16S rDNA序列與GenBank比對結果表明菌株PG1702為托拉斯假單胞桿菌(Pseudomonas tolaasii Paine)。
關鍵詞: 平菇;褐斑病;托拉斯假單胞桿菌
我國作為食用菌生產大國,總產量約占全世界的70%以上,而平菇是我國北方的重要栽培種類。最近幾年北方平菇種植地區平菇褐斑病大面積發生,此病一旦發生,傳播迅速,很難防治,造成了嚴重的經濟損失。褐斑病已經影響了菇農的經濟效益,因此加快對褐斑病的研究、探索有效的預防控制手段迫在眉睫。本研究將形態鑒定方法與分子生物學技術相結合,對引起平菇褐斑病的病原菌進行鑒定,旨在為進一步研究該病害奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 材料
平菇褐斑病菌株: 2007年8月~2008年10月,從遼寧、山東以及北京周邊地區采集大量平菇褐斑病病樣,共分離純化了240多個菌株。
平菇:品種是397,由中國農科院農業資源與農業區劃研究所張金霞老師提供菌種,本實驗室栽培。
1.2 培養基
NA培養基:牛肉浸膏3g,蛋白胨10g,NaCl 5g,瓊脂18g,蒸餾水1000mL,pH7.0。
KB培養基:蛋白胨20g,甘油10g,MgSO41.5g,K2HPO41.5g,瓊脂15g,蒸餾水1000mL,pH7.2。
LB培養基:蛋白胨10 g,酵母膏5 g,NaCl 10 g,蒸餾水1 000 mL,pH 7.0。
平菇培養料:棉籽殼86.8%,麥麩13%,生石灰0.2%,含水量58%。
1.3 平菇栽培方法
采用23 cm×35 cm的聚乙烯塑料袋,每袋裝料量1 kg。養菌期間,溫度、相對濕度控制在25 ℃、65 %左右,發菌天數約為25 d。出菇期溫度控制在12~17 ℃、空氣相對濕度控制在70%左右,給予散射光照,適當通風,當子實體直徑生長到1~2 cm左右時開始接種試驗。
1.4 致病性測定
將根據參考文獻[1]分離純化的菌株在NA平板上25 ℃培養72~96 h,將細菌刷下配置成3×108個/mL的懸浮液20 mL,待平菇子實體直徑為1~2 cm左右時,用毛筆將1 mL菌懸液均勻涂抹在子實體上,針刺法接種[2],設置清水對照,3次重復。接種后保濕24 h[2],之后進行常規管理,并開始觀察發病情況,選出使平菇褐斑病發病快且病情嚴重的菌株。
1.5 病原菌微觀形態觀察[3]
將致病性測定選出的菌株在NA培養基上培養24~48 h后,用亞甲藍染色,油鏡下觀察細菌的形態和大小。
1.6 培養性狀及熒光性的觀察
將致病性測定選出的菌株在KB培養基上培養48 h后觀察菌落形態,在波長254 nm紫外燈下觀察是否有熒光產生。
1.7 16S rDNA 分子鑒定[4,5]
1.7.1 CTAB法提取細菌DNA
將菌株PG1702接種于液體LB培養基中,27 ℃振蕩培養過夜。取2.0 mL培養物15 000 g 離心10 min。沉淀物加入568 μL的TE緩沖液,反復吹打使之重新懸浮,加入30 μL 10%SDS和15 μL的蛋白酶K,混勻,37 ℃溫育1 h。然后加入100 μL 5 mol/L NaCl, 充分混勻,再加入80 μL CTAB/NaCl溶液,混勻后65 ℃溫育10 min,加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)混勻,15 000 g離心10 min,將上清轉入一只新管中,加入0.6~0.8倍體積的異丙醇,輕輕混合15 000 g離心10 min,使DNA沉淀下來,用1.0 mL的70%乙醇洗滌后,再離心棄上清液,在潔凈工作臺中稍加干燥,重溶于20 μL TE緩沖液(含RNaseA<25 ng/mL)中,準備電泳檢測。
1.7.2 PCR擴增
利用16S rDNA的通用擴增引物[5]SF:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和SR:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′進行PCR擴增。
PCR反應體系(50 μL)為:5 μL 10×TB 緩沖液(含2.5 mmol/L Mg2+),dNTP(1.0 mmol/L)5 μL, 正向和反向引物(10 μmol/L)各2.5 μL, 5 mmol/L Taq DNA聚合酶2.0 μL,模板5 μL。
PCR反應條件為:94 ℃ 預變性5 min,94 ℃變性 30 s,52 ℃退火 30 s,72 ℃延伸1 min,30 個循環。
擴增后取3 μL PCR 反應產物在 2.0 %的瓊脂糖凝膠電泳30 min 后,置紫外透射儀下觀察 DNA特異性條帶。
1.7.3 PCR產物測序
PCR產物測序由中國農業科學院作物所完成。
2 結果與分析
2.1 致病性測定結果
致病性測定結果表明:菌株PG1702使平菇397褐斑病發病快且最嚴重。將菌株PG1702接種5袋平菇397的子實體,接種后密切觀察平菇397的生長以及發病情況,發現接種后24 h左右平菇397發病,病情嚴重(見封三圖1),無論是病斑形狀還是發病部位都與平菇褐斑病自然發病的癥狀相同(見封三圖2),對照未發病(見封三圖3)。
2.2 顯微形態
菌株PG1702在蛋白胨瓊脂培養基上培養41 h后,用亞甲藍染色,油鏡下可觀察到細菌呈桿狀,大小約為0.5~0.9 μm×1.4~3.4 μm(圖4);革蘭氏染色陰性;一極或兩極具有一根或多根鞭毛。
2.3 培養性狀
菌株PG1702在NA培養基上培養48 h后,菌落乳白色、粘稠、稍隆起、表面光滑、呈圓形、邊緣整齊(圖5),上述特征與張學敏等[6]描述的托拉斯假單胞桿菌(P. tolaasii)培養形態基本一致。菌株PG1702在KB培養基上培養48 h后,在波長254 nm紫外燈下有熒光產生。
2.4.1 PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳
使用2%的瓊脂糖凝膠進行電泳,結果表明,基因組DNA中擴增出的16S rDNA 核苷酸片斷與DL2 000 Marker 比較, 約在1 500 bp 處有一明亮的PCR 特征性條帶,其分子量大小與菌株16S rDNA的理論值基本相符(圖6),雙蒸水為PCR反應模板進行的對照(CK)則無條帶。
2.4.2 DNA測序結果比對
將供試菌株PG1702測得的16S rDNA序列與GenBank的核酸數據進行比對,與GenBank中的登錄號為AF320990.1、AF094750.1、AF255336.1的相似性均達到99%。因此,判斷菌株PG1702為托拉斯假單胞桿菌(P. tolaasii Paine)。
3 結論與討論
通過致病性測定將從平菇褐斑病中分離純化的240多個菌株中,篩選出使平菇褐斑病發病快且病情嚴重的菌株PG1702為引起平菇細菌性褐斑病的病原菌;顯微觀察結果菌株PG1702與托拉斯假單胞桿菌(P. tolaasii)形態基本相同,進一步對該菌株進行16S rDNA分子檢測,擴增出的序列登錄 GenBank比對后,與托拉斯假單胞桿菌(P. tolaasii)的相似性達到99%,因此確定該菌株為托拉斯假單胞桿菌。
1915年,TOLAAS[7]首次報道了蘑菇細菌性褐斑病,隨后Paine將病原細菌鑒定為P. tolaasii;
1999年,MURATA[8]對平菇褐斑病的致病菌托拉斯假單胞桿菌進行了研究,描述了托拉斯假單胞桿菌不同環境條件下的微觀形態。本研究在國外已有研究的基礎上,借鑒其研究方法同時結合自身的試驗條件對國內采集的平菇褐斑病進行了鑒定,明確其病原為托拉斯假單胞桿菌(P.tolaasii),這為篩選有效的防治藥劑、采取防治措施和抗病品種選育的研究提供了依據。
參考文獻:
[1]BESSETTE AE, KERRIGAN RW, JORDAN DC. Yellow blotch of Pleurotus ostreatus[J]. Appl Environ Microbiol, 1985, 50(6):1535-1537.
[2]GANDY DG. A technique for screening bacteria causing brown blotch of cultivated mushrooms[J]. Rep Glasshouse Crops Res Inst, 1968: 150-154.
[3]方中達.植病研究方法[M]. 北京:北京農業出版社,1998:181-182.
[4]劉雅琴, 任毓忠, 李國英, 等. 新疆棉花細菌性爛鈴病病原菌鑒定[J]. 植物病理學報, 2008, 38(3):238-243.
[5]STACKEBRANDT E, GOODFELLOW M. Nucleic acid techniques in bacterial systematics[M]. New York: John Wiley and Sons. 1991:115-175.
[6]張學敏,楊集昆,譚 琦.食用菌病蟲害防治[M].北京:金盾出版社, 1996:154,158-159,163-164.
[7]TOLAAS AG. A bacterial disease of cultivated mushroom[J]. Phytopathology, 1915, 5: 51-54.
[8]MURATA H. Characteristics of stress response in a mushroom-pathogenic bacterium, Pseudomonas tolaasii, during the interaction with Pleurotus ostreatus and carbon/nitrogen starvation in vitro[J].Mycoscience, 1999,40 (1):81-85.
Identification of a Bacterium Causing Brown
Blotch Disease of Pleurotus ostreatus
JIN Dan1,2,LI Baoju1*,SHI Yanxia1,XIE Xuewen1
1Institute of Vegetables and Flowers, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;
2Institute of Plant Protection, Shenyang Agricultural University, Shenyang, Liaoning 110161, China
Abstract:A bacterium, strain PG1702, identified from more than 240 strains isolated from Pleurotus ostreatus mushrooms collected at different locations in China, was shown to cause severe brown blotch disease of P. ostreatus. Morphological characterization and 16S rDNA sequence analysis confirmed that isolate PG1702 was Pseudomonas tolaasii.
Key words:Pleurotus ostreatus;brown blotch disease;Pseudomonas tolaasii
摘 要: 本文將從平菇(Pleurotus ostreatus)褐斑病中分離純化的240多個菌株中,選出使平菇褐斑病發病快且病情嚴重的菌株PG1702,對其進行致病性試驗,結果表明菌株PG1702為引起平菇細菌性褐斑病的病原菌;顯微形態的觀察和擴增出的16S rDNA序列與GenBank比對結果表明菌株PG1702為托拉斯假單胞桿菌(Pseudomonas tolaasii Paine)。
關鍵詞: 平菇;褐斑病;托拉斯假單胞桿菌
我國作為食用菌生產大國,總產量約占全世界的70%以上,而平菇是我國北方的重要栽培種類。最近幾年北方平菇種植地區平菇褐斑病大面積發生,此病一旦發生,傳播迅速,很難防治,造成了嚴重的經濟損失。褐斑病已經影響了菇農的經濟效益,因此加快對褐斑病的研究、探索有效的預防控制手段迫在眉睫。本研究將形態鑒定方法與分子生物學技術相結合,對引起平菇褐斑病的病原菌進行鑒定,旨在為進一步研究該病害奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 材料
平菇褐斑病菌株: 2007年8月~2008年10月,從遼寧、山東以及北京周邊地區采集大量平菇褐斑病病樣,共分離純化了240多個菌株。
平菇:品種是397,由中國農科院農業資源與農業區劃研究所張金霞老師提供菌種,本實驗室栽培。
1.2 培養基
NA培養基:牛肉浸膏3g,蛋白胨10g,NaCl 5g,瓊脂18g,蒸餾水1000mL,pH7.0。
KB培養基:蛋白胨20g,甘油10g,MgSO41.5g,K2HPO41.5g,瓊脂15g,蒸餾水1000mL,pH7.2。
LB培養基:蛋白胨10 g,酵母膏5 g,NaCl 10 g,蒸餾水1 000 mL,pH 7.0。
平菇培養料:棉籽殼86.8%,麥麩13%,生石灰0.2%,含水量58%。
1.3 平菇栽培方法
采用23 cm×35 cm的聚乙烯塑料袋,每袋裝料量1 kg。養菌期間,溫度、相對濕度控制在25 ℃、65 %左右,發菌天數約為25 d。出菇期溫度控制在12~17 ℃、空氣相對濕度控制在70%左右,給予散射光照,適當通風,當子實體直徑生長到1~2 cm左右時開始接種試驗。
1.4 致病性測定
將根據參考文獻[1]分離純化的菌株在NA平板上25 ℃培養72~96 h,將細菌刷下配置成3×108個/mL的懸浮液20 mL,待平菇子實體直徑為1~2 cm左右時,用毛筆將1 mL菌懸液均勻涂抹在子實體上,針刺法接種[2],設置清水對照,3次重復。接種后保濕24 h[2],之后進行常規管理,并開始觀察發病情況,選出使平菇褐斑病發病快且病情嚴重的菌株。
1.5 病原菌微觀形態觀察[3]
將致病性測定選出的菌株在NA培養基上培養24~48 h后,用亞甲藍染色,油鏡下觀察細菌的形態和大小。
1.6 培養性狀及熒光性的觀察
將致病性測定選出的菌株在KB培養基上培養48 h后觀察菌落形態,在波長254 nm紫外燈下觀察是否有熒光產生。
1.7 16S rDNA 分子鑒定[4,5]
1.7.1 CTAB法提取細菌DNA
將菌株PG1702接種于液體LB培養基中,27 ℃振蕩培養過夜。取2.0 mL培養物15 000 g 離心10 min。沉淀物加入568 μL的TE緩沖液,反復吹打使之重新懸浮,加入30 μL 10%SDS和15 μL的蛋白酶K,混勻,37 ℃溫育1 h。然后加入100 μL 5 mol/L NaCl, 充分混勻,再加入80 μL CTAB/NaCl溶液,混勻后65 ℃溫育10 min,加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)混勻,15 000 g離心10 min,將上清轉入一只新管中,加入0.6~0.8倍體積的異丙醇,輕輕混合15 000 g離心10 min,使DNA沉淀下來,用1.0 mL的70%乙醇洗滌后,再離心棄上清液,在潔凈工作臺中稍加干燥,重溶于20 μL TE緩沖液(含RNaseA<25 ng/mL)中,準備電泳檢測。
1.7.2 PCR擴增
利用16S rDNA的通用擴增引物[5]SF:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和SR:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′進行PCR擴增。
PCR反應體系(50 μL)為:5 μL 10×TB 緩沖液(含2.5 mmol/L Mg2+),dNTP(1.0 mmol/L)5 μL, 正向和反向引物(10 μmol/L)各2.5 μL, 5 mmol/L Taq DNA聚合酶2.0 μL,模板5 μL。
PCR反應條件為:94 ℃ 預變性5 min,94 ℃變性 30 s,52 ℃退火 30 s,72 ℃延伸1 min,30 個循環。
擴增后取3 μL PCR 反應產物在 2.0 %的瓊脂糖凝膠電泳30 min 后,置紫外透射儀下觀察 DNA特異性條帶。
1.7.3 PCR產物測序
PCR產物測序由中國農業科學院作物所完成。
2 結果與分析
2.1 致病性測定結果
致病性測定結果表明:菌株PG1702使平菇397褐斑病發病快且最嚴重。將菌株PG1702接種5袋平菇397的子實體,接種后密切觀察平菇397的生長以及發病情況,發現接種后24 h左右平菇397發病,病情嚴重(見封三圖1),無論是病斑形狀還是發病部位都與平菇褐斑病自然發病的癥狀相同(見封三圖2),對照未發病(見封三圖3)。
2.2 顯微形態
菌株PG1702在蛋白胨瓊脂培養基上培養41 h后,用亞甲藍染色,油鏡下可觀察到細菌呈桿狀,大小約為0.5~0.9 μm×1.4~3.4 μm(圖4);革蘭氏染色陰性;一極或兩極具有一根或多根鞭毛。
2.3 培養性狀
菌株PG1702在NA培養基上培養48 h后,菌落乳白色、粘稠、稍隆起、表面光滑、呈圓形、邊緣整齊(圖5),上述特征與張學敏等[6]描述的托拉斯假單胞桿菌(P. tolaasii)培養形態基本一致。菌株PG1702在KB培養基上培養48 h后,在波長254 nm紫外燈下有熒光產生。
2.4.1 PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳
使用2%的瓊脂糖凝膠進行電泳,結果表明,基因組DNA中擴增出的16S rDNA 核苷酸片斷與DL2 000 Marker 比較, 約在1 500 bp 處有一明亮的PCR 特征性條帶,其分子量大小與菌株16S rDNA的理論值基本相符(圖6),雙蒸水為PCR反應模板進行的對照(CK)則無條帶。
2.4.2 DNA測序結果比對
將供試菌株PG1702測得的16S rDNA序列與GenBank的核酸數據進行比對,與GenBank中的登錄號為AF320990.1、AF094750.1、AF255336.1的相似性均達到99%。因此,判斷菌株PG1702為托拉斯假單胞桿菌(P. tolaasii Paine)。
3 結論與討論
通過致病性測定將從平菇褐斑病中分離純化的240多個菌株中,篩選出使平菇褐斑病發病快且病情嚴重的菌株PG1702為引起平菇細菌性褐斑病的病原菌;顯微觀察結果菌株PG1702與托拉斯假單胞桿菌(P. tolaasii)形態基本相同,進一步對該菌株進行16S rDNA分子檢測,擴增出的序列登錄 GenBank比對后,與托拉斯假單胞桿菌(P. tolaasii)的相似性達到99%,因此確定該菌株為托拉斯假單胞桿菌。
1915年,TOLAAS[7]首次報道了蘑菇細菌性褐斑病,隨后Paine將病原細菌鑒定為P. tolaasii;
1999年,MURATA[8]對平菇褐斑病的致病菌托拉斯假單胞桿菌進行了研究,描述了托拉斯假單胞桿菌不同環境條件下的微觀形態。本研究在國外已有研究的基礎上,借鑒其研究方法同時結合自身的試驗條件對國內采集的平菇褐斑病進行了鑒定,明確其病原為托拉斯假單胞桿菌(P.tolaasii),這為篩選有效的防治藥劑、采取防治措施和抗病品種選育的研究提供了依據。
參考文獻:
[1]BESSETTE AE, KERRIGAN RW, JORDAN DC. Yellow blotch of Pleurotus ostreatus[J]. Appl Environ Microbiol, 1985, 50(6):1535-1537.
[2]GANDY DG. A technique for screening bacteria causing brown blotch of cultivated mushrooms[J]. Rep Glasshouse Crops Res Inst, 1968: 150-154.
[3]方中達.植病研究方法[M]. 北京:北京農業出版社,1998:181-182.
[4]劉雅琴, 任毓忠, 李國英, 等. 新疆棉花細菌性爛鈴病病原菌鑒定[J]. 植物病理學報, 2008, 38(3):238-243.
[5]STACKEBRANDT E, GOODFELLOW M. Nucleic acid techniques in bacterial systematics[M]. New York: John Wiley and Sons. 1991:115-175.
[6]張學敏,楊集昆,譚 琦.食用菌病蟲害防治[M].北京:金盾出版社, 1996:154,158-159,163-164.
[7]TOLAAS AG. A bacterial disease of cultivated mushroom[J]. Phytopathology, 1915, 5: 51-54.
[8]MURATA H. Characteristics of stress response in a mushroom-pathogenic bacterium, Pseudomonas tolaasii, during the interaction with Pleurotus ostreatus and carbon/nitrogen starvation in vitro[J].Mycoscience, 1999,40 (1):81-85.
Identification of a Bacterium Causing Brown
Blotch Disease of Pleurotus ostreatus
JIN Dan1,2,LI Baoju1*,SHI Yanxia1,XIE Xuewen1
1Institute of Vegetables and Flowers, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;
2Institute of Plant Protection, Shenyang Agricultural University, Shenyang, Liaoning 110161, China
Abstract:A bacterium, strain PG1702, identified from more than 240 strains isolated from Pleurotus ostreatus mushrooms collected at different locations in China, was shown to cause severe brown blotch disease of P. ostreatus. Morphological characterization and 16S rDNA sequence analysis confirmed that isolate PG1702 was Pseudomonas tolaasii.
Key words:Pleurotus ostreatus;brown blotch disease;Pseudomonas tolaasii
