作者單位：1 200041 上海，上海市第一人民醫院分院腫瘤科
2 上海，解放軍第85醫院
3 上海，上海白衣緣生物科技有限公司(Δ通訊作者)
【摘要】 目的 探討灰樹花β多糖在抗腫瘤細胞中的作用和協同化療藥物增加其殺傷腫瘤細胞的作用。另外通過對p53和MDM2的研究，發現了兩者協同作用的分子機理。方法 用CCK-8方法測定了灰樹花β多糖協同化療藥物處理HCT116后的細胞存活率(cell survival rate，CSR)；用PCR的方法測定了p53、MDM2基因的表達。結果 (1)灰樹花β多糖對腫瘤細胞的直接殺傷作用高于靈芝多糖。(2)灰樹花β多糖協同化療藥物增強其對腫瘤細胞的殺傷作用。(3)灰樹花β多糖協同化療藥物的分子機理和抑制抑癌基因p53的拮抗物MDM2基因的表達相關。結論 灰樹花β多糖具有直接殺傷腫瘤作用和化學藥物協同抗腫瘤作用。
【關鍵詞】 灰樹花；化療藥物；p53；MDM2
The initial exploration of antitumor action and its molecular mechanism by the Grifola frondosa polysaccharide synergistic with chemotherapeutic drugs
LU Zheng-yu，PU Hong， FU Rong-jie，et al.Department of Oncology，The Branch of the Shanghai First People’s Hospital，Shanghai 200041，China
【Abstract】 Objective The efficiency of anticancer therapy is limited by drug reistance.Recent studies suggest that a polysaccharide extracted from Grifola frondosa is able to kill cancer cells in vivo and in vitro.However， the molecular basis for the polysaccharide from Grifola frondosa synergistic effects with cytotoxic drugs has to be well defined.Methods HCT116 cell survival rate were monitoued by CCK-8 kit.p53 and MDM2 gene expression were checked by semiquantitative PCR analysis of cellular RNA.Results Here we showed the polysaccharide from Grifola frondosa had more great anti-cancer effect than shell-broken spores of G. lucidum in HCT116 cell.Moreover the polysaccharide from Grifola frodosa was detected synergistic effects with cytotoxic drug (ADM). Conclusion We present the evidence that anti-apoptotic gene MDM2 expression may be involved in augented the polysaccharide from Grifola frondosa induced HCT116 cells sensitivity to ADM-treatment.
【Key words】 grifola frondosa；chemotherapeutic drug；p53；MDM2
灰樹花(Grifola frondosa)是一種生長在亞熱帶至溫帶的大型藥、食兼用珍稀食用菌，又名栗蘑、貝葉多孔菌等，日本稱之為“舞茸”。在分類學上屬擔子菌綱多孔菌科，其口味鮮美、營養豐富，含有眾多活性物質，灰樹花多糖就是最主要的一類活性成分。灰樹花多糖除含有β-1，6-支鏈β-1，3-葡聚糖外還含有大量高度分支化的β-1，3-支鏈β-1，6-葡聚糖，研究表明，這種特定的結構使其擁有更強的生物調節活性［６］。作為一種生物反應調節劑(BRM)，灰樹花多糖具有增強免疫功能、抑制腫瘤、抗HIV病毒、穩定血壓、降低血糖、改善脂肪代謝等廣泛的生理活性［１］。
灰樹花β多糖具有明顯的抗腫瘤作用，能激活機體免疫細胞群如T淋巴細胞、巨噬細胞和自然殺傷細胞，并可促進多種細胞因子的分泌如IL-2、IL-8、IL-12、γ-INF、TNF-α等，增強腫瘤局部免疫反應，抑制腫瘤發生和轉移［２～４］。
化療藥物對正常細胞的毒副作用在一定程度上限制了它對惡性腫瘤的治療作用。
1 材料與方法
1.1 細胞培養 用10%牛血清(PAA Laboratories Gmbh)DMEM(PAA Laboratories Gmbh)培養液在37℃、5%CO2條件下培養人腸癌細胞系HCT116。
1.2 細胞毒性分析 取對數生長期HCT116細胞，常規消化成2×１０４/ml的單細胞懸液，接種于96孔細胞培養板，每孔100μl DMEM細胞培養液。5%CO2、37℃ 環境中培養24h后對HCT116細胞分別用零處理；一天灰樹花β多糖(3μg/ml)；一天2μg/ml化療藥物(阿霉素2μg/ml)；二天2μg/ml化療藥物(阿霉素2μg/ml)；第一天2μg/ml化療藥物(阿霉素2μg/ml)、第二天灰樹花β多糖(3μg/ml)的五種不同的方法處理，次日每孔細胞中加入5μl的CCK-8試劑，5%CO2、37℃環境中培養2h后，在酶標儀上波長450nm處讀取光密度A值，計算細胞存活率(cell survival rate，CSR)。
公式：
1.3 統計學處理 所有數據均以均數表示，采用t檢驗。
1.4 RNA抽提和RT-PCT RNeasy kit (Qiagen)提取藥物處理過的HCT116細胞總RNA并合成相應的cDNA，分別對p53和Mdm2作RT-PCR，PCR產物通過瓊脂糖電泳觀察結果。引物序列：p53正5′-GGCCATCTACAAGCAGTCAC-3′，p53反5′-GAGAGGAGCTGGTGTTGTTG-3′；Mdm2正5′-GGTGAGGAGCAGGCAATTG-3′，Mdm2反5′-GCGTCCCTGTAGATTCACTGC-3′。
2 實驗結果
2.1 灰樹花β多糖直接抑制腫瘤細胞的作用 眾所周知，靈芝破壁孢子粉是目前被廣泛用于腫瘤患者輔助治療各種腫瘤的一種保健藥物。為了探究灰樹花［１］對腫瘤細胞直接的殺傷作用［６～７］，我們用各種濃度的靈芝破壁孢子粉和灰樹花β多糖對人的腸腫瘤細胞HCT116株進行處理，48h后測得腫瘤細胞HCT116的生存率，結果如圖1所示，我們可以觀察到與靈芝破壁孢子粉相比，灰樹花β多糖對腫瘤細胞的殺傷作用更強大［８］，而且這種作用是隨著劑量的遞增而增強的。
圖1 灰樹花β多糖和靈芝破壁孢子粉對腫瘤細胞的直接抑制作用
用各種不同劑量的灰樹花β多糖和靈芝破壁孢子粉
作用于處理HCT116細胞48h后，細胞生存率結果用
Cell Counting Kit-8檢測獲得 另外，在這個實驗中我們所用的起始濃度非常低(從0.05μg/ml)，由此可以判斷灰樹花β多糖從很低的濃度開始就有明顯的殺傷腫瘤細胞的作用。
2.2 灰樹花β多糖對化療藥物的協同抗腫瘤作用 為了檢測灰樹花β多糖、化療藥物(阿霉素)以及二者一起使用的協同作用，我們對HCT116細胞分別用零處理；一天灰樹花β多糖；一天化療藥物(阿霉素)；二天化療藥物(阿霉素)；第一天化療藥物(阿霉素)；第二天灰樹花β多糖的五種不同的方法處理。次日再用CCK-8藥盒測得HCT116細胞的生(殘)存率，如圖2所示：我們發現和零處理比較，單用灰樹花β多糖有較弱的直接殺傷腫瘤細胞的能力(約為9%的殺傷力)，而化療藥物(阿霉素)單日和雙日使用均有十分明顯的殺傷腫瘤細胞的能力(約50%和78%的殺傷力)。而第一天用化療藥物(阿霉素)第二天再用灰樹花β多糖處理，其二者的協同作用對腫瘤細胞有高達80%的殺傷力。眾所周知，化療藥物(阿霉素)雖然對腫瘤細胞殺傷力強，但是毒副作用也十分明顯。病人長期連續使用會嚴重影響其生活質量，也阻礙了治療的深入進行。而灰樹花本身是一種幫助調節和恢復各種身體機能的真菌多糖類滋補品。在本實驗中，我們發現第一天用化療藥物處理，第二天改用灰樹花β多糖的處理，不但沒有減弱其直接對腫瘤細胞的殺傷能力(80%)，而且還能在臨床應用時幫助恢復病人的整體機能和大大提高病人的生活質量。
在這實驗中同時我們也測試了第一天用灰樹花β多糖、第二天化療藥物(阿霉素)這樣的順序組合其協同作用的效果遠遠沒有前一種順序的強(只有50%的殺傷力，其實驗數據未顯示)。另外，除了阿霉素，我們還測試了其他多種臨床上常用的化療藥物如：5-FU、CDDP、泰素等均有明顯的協同作用。
圖2 灰樹花β多糖與化療藥物協同抗腫瘤作用
分別用灰樹花β多糖3μg/ml和化療藥物(阿霉素)2μg/ml處理
HCT116細胞，細胞生存率結果用Cell Counting Kit-8檢測獲得2.3 灰樹花β多糖協同化療藥物抑制MDM2基因的表達 在這個實驗中，人腸腫瘤HCT116細胞的抑癌基因p53表達為野生型。p53是一種非常重要的抑癌基因，它的功能主要表現為控制細胞的生長和促進細胞凋亡［１０，１１］。所以p53蛋白質又被稱為“警戒蛋白”，在正常細胞中p53基因表達量是十分低下的，但是有些腫瘤細胞中p53的表達卻異常高，HCT116細胞株就是一例。通常認為p53的表達異常高的腫瘤細胞中MDM2的量也十分高：即MDM2拮抗了p53的功能［１２～１３］。本文為了研究灰樹花β多糖和化療藥物抗腫瘤細胞協同作用的分子機理，我們用PCR方法，半定量化檢測了p53基因和MDM2［１４～１６］基因在HCT116細胞中的表達。對HCT116細胞的處理是：零處理、1日灰樹花β多糖、1日化療藥物(阿霉素)、2日化療藥物(阿霉素)；第一天化療藥物(阿霉素)；第二天灰樹花β多糖處理五種不同方法。實驗結果顯示(圖3)，HCT116細胞中p53基因的表達總體水平都十分高，但有趣的是，用灰樹花β多糖處理后MDM2基因的表達下降，而且在第一天用化療藥物(阿霉素)第二天用灰樹花β多糖處理后這種降低MDM2基因表達的作用被大大的增強了。
圖3 灰樹花β多糖與化療藥物協同作用
對MDM2基因表達的影響
分別用灰樹花β多糖3μg/ml和化療藥物(阿霉素)
2μg/ml處理HCT116細胞，抽提RNA用RT-PCR分析
p53和MDM2基因的表達，GAPDH作為對照 這樣的實驗結果讓我們有理由相信在HCT116細胞中，第一天用化療藥物(阿霉素)；第二天用灰樹花β多糖的處理方式在抗腫瘤作用中的協同作用是通過抑制抑癌基因的拮抗物MDM2基因的表達而實現的。
3 討論
灰樹花的抗腫瘤功效一直得到國際學術界的注目。尤其是灰樹花β多糖在提高人體免疫機能等方面的研究更是層出不窮。但是灰樹花β多糖和化療藥物協同抗腫瘤作用以及分子機理的研究卻還有待開發。本研究中我們發現了灰樹花β多糖直接殺傷腫瘤的作用高于目前被廣泛使用的靈芝破壁孢子粉。另外灰樹花β多糖和化療藥物的協同抗腫瘤作用也十分明顯。通過更深入的分子生物學研究我們發現著名的抑癌基因p53和其拮抗蛋白MDM2基因的表達下降參與了這個作用。
p53是目前世界上被研究得最為透徹的抑癌基因。它的主要功能是當細胞由于外界因素而使DNA遭受損傷時，p53基因即被激活，由此而激活其下游的蛋白質p21(sip1/waf1/sidi1)的表達而使細胞停止生長并進行修復，而當DNA損傷嚴重時，p53又能啟動其凋亡信號途徑而導致細胞死亡。在正常細胞中p53的表達量非常低，而在有些腫瘤細胞中p53的表達卻異常的高，這是因為這些腫瘤細胞中p53的拮抗蛋白MDM2的表達相當高、嚴重抑制了p53的正常功能。本研究中我們發現灰樹花β多糖和化療藥物的協同作用可以大大地降低MDM2基因的表達。
發掘祖國醫藥寶庫并且通過現代生物技術手段闡明其作用的分子機理是中醫中藥現代化的一條切實可行的途徑。我們在這個研究中雖然只是初步的嘗試，但是得到了一個令人振奮的結果。
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