第四節(jié)　　菌種的生產

一、一級種的生產

　　一級種的生產指試管母種的擴大繁殖。一般由自己分離培養(yǎng)獲得的母種，或從專門從事菌種研究部門引進的母種都要進行擴大繁殖，以增加母種數(shù)量，再用于繁殖原種。母種轉管擴繁次數(shù)不宜過多，否則會降低菌種的生活力，影響產質量。對于沒有母種生產經驗缺乏母咱質量鑒別能力的制種單位，晝不進行一級種的生產。

１、培養(yǎng)基配制

（１）馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基

①配方參見上述一級種培養(yǎng)基；

②制作方法：選擇質量好的馬鈴薯，去皮，挖去芽眼，削掉青綠部分，切成1-2 毫米厚薄片。稱取200克,加水1000毫升,煮沸后,小火保持30分鐘。然后用八層沾濕紗布過濾,濾液中加入預告浸泡擰干的瓊脂,繼續(xù)加熱, 并不斷用玻璃棒攪拌直至瓊脂完全溶化,加葡萄糖攪勻,最后用清水補足至1000毫升,即可進行分裝。

（２）綜合馬鈴薯培養(yǎng)基

①配方參見上述一級種培養(yǎng)基；

②制作同PDA培養(yǎng)基,在加入葡萄糖同時加入磷酸氫二鉀,硫酸鎂,維生素B1等。

（３）堆肥浸汁葡萄糖培養(yǎng)基

①配方參見上述一級種培養(yǎng)基；

②制作方法：先把堆肥剪碎成1-2厘米長,加入水1000毫升煮沸后,用小火保持30 分鐘,隨后的過程同上。

２、分裝

　　上述制備的母種培養(yǎng)基，趁熱時盡快分裝試管。用下口瓷量杯或用玻璃漏斗夾在滴定架上，下接一段乳膠管,用彈簧夾夾隹膠管,左手握試管, 右手控制培養(yǎng)基流量,使每支試管裝量相當于試管長度的1/4左右。

３、塞棉塞：棉絮可用未經脫脂的原棉。一種方法是用手把棉絮做成棉塞塞入試管，松緊度以檢查時用手抓隹棉塞不脫落為度。棉塞要緊貼管壁不起皺紋，棉塞塞入管中的部分約為２厘米左右，外露部分約占棉塞總長的1/3左右。 另一種方法是事先把棉絮用紗布包扎成塞子，規(guī)格是根據不同試管大小而定，松緊度以及塞入試管的要求同上。

４、滅菌：將制好的試管培養(yǎng)基用紗布包扎成一捆，在棉塞上蓋上一層牛皮紙，以防止滅菌時冷凝水沾濕棉塞，隨后放入手提式高壓鍋中進行滅菌，滅菌溫度達121℃維持30分鐘,具體操作要求參照高壓蒸汽滅菌法。停火自然降壓至零后， 打開高壓鍋蓋。

５、擺斜面：將滅菌后的試管趁熱放入擺斜面的專用木框內，木框底部前邊支一小木塊使之稍傾斜，使木框內的試管培養(yǎng)基擺成斜面，一般長度的為試管的2/3即可,擺好斜面后在上面蓋一保溫棉,防止試管冷卻過快產生太多的冷凝水。

６、檢驗：制好的斜面要進行滅菌質量檢查。隨機抽取數(shù)根已滅菌的試管培養(yǎng)基放在28-30℃下進行三天空白培養(yǎng),檢查確實沒有污染雜菌,斜面才能正式接種使用。

７、接種：接種前，把培養(yǎng)基放入接種箱中進行消毒，消毒要求按前述進行。接種時，手和接種針用75%的酒精棉球揩擦,點燃酒精燈,使火焰周圍空間形成無菌區(qū)， 左手平行并排拿起母種試管和供接種用的斜面試管，兩支試管斜面要向上，管口要齊平。右手大拇指和食指持接種針，在酒精火焰上灼燒滅菌。將左手試管移至火焰旁，用右手的小指、無名指和手掌，在火焰旁分別夾下兩試管的棉塞，將試管口在火焰上稍微烤一下，以殺滅管口上的雜菌，隨后將管口移至距火焰1-2厘米處， 用冷卻了的接種針將母種縱橫切割成許多小方塊，然后挑取一小塊，迅速移入被接咱的試管斜面的中前部，輕輕抽出接種針，再烤一下試管口，迅速塞上過火焰的棉塞，如此連續(xù)操作，１支母種一般可擴接試管30-40支。 技術要點：整個操作過程均須在火焰旁進行無菌操作，母種上的接種塊以及周邊已老化的世界經濟　要移接擴管，盡量挑選菌齡短的菌絲塊進行生產。

８、貼標簽培養(yǎng)：試管從接種箱取出之前，應逐支試管正面的上方貼上標簽，寫明菌種編號、接種日期，隨后把試管置培養(yǎng)箱（室）中24℃下培養(yǎng)。

二、二級種的生產

　　二級種是由一級種繁殖而來，常稱為原種主要用于繁殖三級種（栽培種），以滿足大量繁殖栽培種的需要。

１、培養(yǎng)基配制

（１）糞草培養(yǎng)基：

①配方見上述；

②制作：把發(fā)酵麥稈切短，大約為3-5厘米,加入粉碎牛糞粉,麩皮,石膏,碳酸鈣,石灰,充分拌勻,加水調濕使培養(yǎng)基均勻吸水至含水量達65%左右,隨后鏟成一堆讓培養(yǎng)基水分平衡2-3小時,即可裝瓶。

（２）發(fā)酵牛糞粉培養(yǎng)基

①配方見上述

②制作：發(fā)酵后曬干牛糞粉經過粉碎過篩（篩孔0.5×0.5厘米），拌入碳酸鈣，用1%石灰水調整含水量達65%左右,pH值約為8.5,堆成一堆使牛糞粉水分平衡, 裝瓶前再攪拌均勻。

（３）發(fā)酵棉籽殼培養(yǎng)基

①配方見上述

②制作：棉籽殼80% ,牛糞粉20%,石膏1%,石灰2%,混勻后加水調濕含水量達70%, 進行建堆發(fā)酵,堆寬1.5米,高1.2-1.5米,長度根據數(shù)量而定,當料溫達65-70 ℃時可進行翻堆,一般3-4天翻一次,每次翻堆時應補充1%石灰水,含水量控制在65-70%之間, 經過4-5次翻堆,棉籽殼長滿大量高溫放線菌而腐熟,這時已適合蘑菇菌絲的生長,腐熟棉籽殼曬干備用。制種時把腐熟棉籽殼按配方要求與其它輔料充分拌勻，用１％石灰水調節(jié)含水量達65%左右，堆成一堆使水分充分平衡均勻， 裝瓶前再攪拌均勻即可。

（４）羊糞粉培養(yǎng)基

①配方見上述

②制作同發(fā)酵牛糞粉培養(yǎng)基

（５）礦石培養(yǎng)基

①配方見上述

②制作：把培養(yǎng)料混合均勻，用１％石灰水調整含水量達60%左右,攪拌均勻即可裝瓶。